牛胚胎原代和继代细胞核移植结果比较

比较了原代和继代核移植的操作各环节以及核移植胚胎在体外发育能力上的差异。通过显微操作将体外受精发育而来的８～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入激活的去核卵母细胞的卵周隙内,并用８０Ｖ/mm、４０us２次电脉冲诱导卵裂球与去核卵母细胞融合,借此进行牛胚胎的原代核移 体外发育来的８～３２细胞期的原代核移植胚胎作为供体,用原代核移植相同的方法进行牛胚胎的继代移植。原代核移植的存活率和融合率（８７．３％和６８．５     

家兔胚胎细胞核移植与连续移植

将发育不同时期的兔胚和移核胚的卵裂球细胞核与去核的成熟卵母细胞共同组成移核胚,通过中间受体培养和移植实验检验胚胎的发育能力。结果表明,（１）兔囊胚之前各个时期的胚胎细胞核均可使移核胚发育到囊胚;（２）胚胎极化前后的卵裂球参与组成的移核胚发育到囊胚的比例无显著差异。但极化后 ６４细胞胚的卵裂球与去核卵母细胞的融合率低于极化前的 ８细胞胚胎卵裂球;（３）兔 １６细胞胚与去核的卵母细胞组成的移核胚可以发育到期,产仔率为 ３．１６％ ;（４）兔移核胚卵裂球用于连续核移植,其后 ２ 代均可发育成囊胚,其中第 １ 代移核胚与第 ２ 代移核胚发育率相似,但显著高于第 ３ 代移核胚;（５）兔移核胚和各代连续移核胚卵裂球与去核卵的融合率无显著差异。     

兔核移植胚胎的克隆研究

本研究改进了兔受体卵母细胞的去核程序及供体卵裂球的处理方法，并对核移植胚的体外克隆、继代克隆及克隆胚的体内发育进行了试验。结果表明：卵龄对受体卵母细胞的去核具有显著的影响，卵龄为１５～１８ｈ的去核率为１００％（４５／４５），显著高于１３～１４ｈ的４６．６％（７／１５），Ｐ＜０．０１。ＤＮＡ合成抑制剂Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ处理１６－细胞期卵裂球后，重组胚的囊胚发育率５４％（２０／３７）高于未处理组的４５％（１４／３１），Ｐ＜０．０５。从２枚１６－细胞供体胚分别获得来自一个供体胚的９枚和７枚核移植克隆囊胚，囊胚发育率为５１．６（１６／３１）。然而第一次继代核移植胚的囊胚发育率仅为１１．５％（６／５２）。１６－及３２－细胞期卵裂球的重组胚可发育至产仔，共获２窝８只仔兔。其中１只、２只、２只和３只仔兔分别来自４个供体胚。     

体内、外卵母细胞对猪体细胞克隆胚胎发育潜力的影响

为探讨猪体内、外成熟卵母细胞对核移植重组胚胎发育能力的影响,试验通过激素促排获得体内成熟卵母细胞和收集废弃卵巢获取体外成熟的卵母细胞,分别构建核移植重组胚,比较其卵裂率、囊胚率及胚胎移植受孕情况。结果显示,PGC+PMSG+HCG组的平均排卵数（27.8枚/头）显著高于PGC+HCG （12.5枚/头）、PMSG+HCG （13.7枚/头）及自然发情组（11.5枚/头）（P<0.05）,体内收集到的卵母细胞,可用于构建核移植重组胚的可用卵率均达到90%以上,与其他处理组差异不显著（P>0.05）,说明通过激素处理可获得更多的可用卵母细胞,而且卵母细胞的质量没有显著差异;以体内和体外成熟卵母细胞作为核移植受体构建的克隆胚胎,二者的胚胎融合率（80.31%和79.29%）和卵裂率（90.40%和86.51%）差异均不显著（P>0.05）,但来自体内成熟卵母细胞克隆的胚胎发育至囊胚期的比例显著升高（P<0.05）;将体内、外成熟卵母细胞构建的核移植重组胚分别移植代孕母猪,头平均移植30或60枚时,体内成熟卵母构建的克隆胚胎移植出生仔猪10头,而体外培养卵母细胞构建的克隆胚胎均未着床受孕,表明通过激素促排获得的卵母细胞质量更好,能显著提高克隆胚胎的囊胚率,减少胚胎移植数量,提高代孕母猪的怀孕率。     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

牛胚胎体外生产技术的简化研究

利用屠宰牛卵巢分离的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育率为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验。结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００～２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞的标准密度（５０枚／平皿）培养，其卵裂率（５７．６％比６２．５％）和囊胚发育率（２３．７％比２９．１％）没有显著差异（Ｐ＞０．０５），体外授精时间可从成熟培养后２２ｈ延长至２７ｈ，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化，卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留卵丘细胞再培养４８ｈ形成的单层细胞，可代替标准方法制作的单层小滴用于体外受精胚胎的共同培养，供胚胎发育培养的单层细胞使用多次不影响囊胚发育率，经简化的ＩＶＦ技术获得的胚胎非手术移入情期同步受体牛子宫角２～２．５个月后直检有５８．３％（７／１２）妊娠。我们认为，传统的牛胚胎体外生产技术经过简化可以提高生产效率，不会减少囊胚发育率和妊娠率，值得推广应用。     

牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究

本试验主要比较了离子霉素、电脉冲两种方法激活牛、羊体外成熟卵母细胞的效率。两种激活方法中。牛胚胎卵裂率无显著差异（90．61％对94．40％，P〉0．05），而离子霉素激活胚胎的囊胚发育率极显著高于电激活方法（12．3％对2．4％，P〈0．01）。两种方法对羊胚胎的研究中，羊胚胎卵裂率无显著差异（72．4％对77．4％，P〉0．05）。但是离子霉素激活胚胎的囊胚发育率显著高于电激活方法（3．67％对10．40％，P〈0．05）。本试验中还比较了用化学激活法（离子霉素）激活牛体外成熟卵母细胞后，用SOFaa体系培养，换液与不换液对孤雌激活胚胎体外发育的影响。结果表明：在第4天不换液的胚胎卵裂率和囊胚率极显著高于换液的胚胎（11．64％对3．49％。P〈0．01）。     

兔胚胎核移植操作条件的建立

本文对影响家兔胚胎细胞核移植的几个重要因素进行了研究。以不同的融合电场强度对重组胚进行处理，结果表明脉冲参数为１．６５ｋｖ／ｃｍ，脉宽为８５μｓ，脉冲数为１时，融合率达到７７．１％。显著高于其它场强的融合率。当场强增加至２．５０ｋｖ／ｃｍ时，多数重组胚发生溶解。融合液中的离子成份对重组胚的激活有重要影响。以０．３Ｍ甘露醇为融合液时，电激三次的激活率（５０％）显著高于一次（３６％）和二次（２２．２％Ｐ＜０．０５）。当加入１００μｎＣａ２＋时，电激三次后的激活率达到７１．４％，显著高于电激一次（４８％，Ｐ＜０．０１）和二次（６１．３％，Ｐ＜０．０５）。多次电激还可提高重组胚的发育率，当有Ｃａ２＋存在时，三次电激后的囊胚发育率为３１．４％。此外，随着卵母细胞卵龄的增加，重组胚的囊胚发育率下降，而融合胚的碎裂率则增高。当卵龄为ＨＣＧ后２１—２４小时，碎裂率高达５２％。对８－，１６－，３２－细胞期卵裂球的重组胚体外发育能力的研究表明，８－细胞期卵裂球的重组胚之囊胚发育率显著高于１６－及３２－细胞期卵裂的重组胚（３６．４％比２６％、２７．５％，Ｐ＜０．０５）。将部分３２－细胞期卵裂球的重组胚移入受体后，产出了３只核移植     

牛胚胎体外生产技术的简化研究

利用屠宰牛卵巢分离的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育率为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验。结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００￣２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞的标准密度（５０枚／平皿）培养，其卵裂率（５７．６％比６２．５％）和囊胚发育率（２３．７％比２９．１％）没有显著差异（Ｐ〉０．０５），体外授精时间可从成熟培养后２２ｈ延长至２７ｈ，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化，卵母     

牛性机能发育阶段与卵泡、黄体因素对卵母细胞体外成熟及体外受精的影响

利用屠宰母牛卵巢．对来自不同性机能发育阶段母牛的卵巢卵母细胞．不同状态卵巢卵泡的卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）进行了系列研究。结果表明．来自初情期、性成熟母牛卵巢的卵母细胞受精后的卵裂率（ ７４． ７％和 ８１． ５％）、囊胚率（ ２３．０％和 ２６． ８％）显著高于来自初情期前母牛卵巢卵母细胞的卵裂率（１８．８％）和囊胚率（１．８％）,Ｐ＜０．０５;有黄体卵巢的卵母细胞体外受精后的发育能力显著低于无黄体卵巢卵母细胞（卵裂率５８．０％：７９． ９％,囊胚率１３．％：２７．１％,Ｐ＜０．０５）;优势卵泡的有无对卵母细胞的卵裂率和囊胚率无明显影响。     

不同超数排卵方法所获羔山羊卵母细胞体外成熟率及体外受精率的比较

本研究观察了不同超排处理方法对羔山羊卵母细胞体外成熟及体外受精的影响，并将体外受精胚胎进行了移植，以便探讨利用羔山羊卵母细胞生产体外受精胚胎的技术途径。对２～４月龄羔山羊用ＦＳＨ、ＦＳＨ＋ＬＨ（静脉注射）和ＦＳＨ＋ＬＨ（肌肉注射）三种方法进行超排处理，平均分别回收１６．０、２０．３和１５．０枚卵母细胞。将这些卵母细胞进行２０～２４ｈ的成熟培养后，其成熟率分别为４５．５％，４４．４％和７６．５％。成熟卵母细胞经体外受精，体外发育培养后其２～４细胞胚胎的发生率分别为５．６％ａ、６．７％和３１．７％ｂ（ｂ，ｖｓ，ａ，Ｐ＜０．０５）。将９枚２～４细胞期胚胎移植给６只受体母羊，结果有２只妊娠并产羔２只。     

奶牛离体PBMC和体内免疫应答的个体差异及其机理的研究

检测１５头奶牛离体外周血单核细胞和体内产生抗体免疫应答的结果表明，１．０μｇ／ｍｌ的ＰＷＭ或ＳＥＢ使ＰＢＭＣ增殖达最高值，但在分泌Ｉｇ中却表现出不同作用，还发现在群体内离体细胞增殖强度的变异程度小于分泌的Ｉｇ量的变异程度。     

猪卵母细胞体外成熟中膜电位与成熟关系的研究

本文应用细胞内微电极技术，分析测试了不同类别的猪卵母细胞，在体外成熟中不同时期的膜电位。结果表明，在体外成熟培养前，Ａ类和Ｂ类未成熟卵母细胞的膜电位为较小的负值（－８．９７＋０．５，－１．５５±０．６ｍＶ），Ｃ类则为较小的正值（＋２．４０±０．３ｍＶ）。成熟培养后，卵母细胞首先发生超极化，随着培养时间的延长，卵母细胞膜去极化并极性转化为正值。成熟卵母细胞的膜电位为正值（＋２６．５０±１．０ｍＶ）。本文还讨论了猪卵母细胞可能的体外成熟机理。     

甲醛保护豆饼的动态降解及其对日粮体外发酵影响的研究

研究了不同浓度甲醛保护豆饼蛋白质后对蛋白质动态降解以及日粮体外发酵的影响。结果表明,当甲醛水平为0.6g/100gCP时,蛋白质的快速降解部分减少,慢速降解部分增加,降解速度变慢。根据降解模型p=a+b(1-e~(-ct))判断,0.6％的甲醛即能增加过瘤胃蛋白30％,又不会对蛋白质过保护。用甲醛保护豆饼配合日粮时,对有机物的降解率和有机物合成微生物的效率没有显著影响(P>0.05),但是甲醛保护能使可降解氮的利用效率从0.7928提高到0.8482(P<0.05)。     

乳突类圆线虫人工培养初试

乳突类圆线虫人工培养初试陈刚（青海畜牧兽医学院，西宁８１０００３）孔繁瑶，蒋金书，韩谦（北京农业大学，北京１０００９４）作者对１．丝状幼虫的消毒和脱皮方法；２．不同培养基和不同附加因子对丝状动虫体外培养的影响；３．最佳培养气相组成及ｐＨ值；４．二步培...     

利用体外法研究粗饲料的产气曲线及5种养分的发酵系数

利用自行设计的体外发酵产气装置，采用Jerson等     

海南霉素的遗传毒性研究及其致癌性预测 1．海南霉素的体外致突变性研究

海南霉素是我国研制成功的第一个聚醚类抗生素，它具有良好的抗球虫作用。本文从遗传毒理学试验的生物学意义方面考虑，选择了２种体外致突变试验方法，对海南霉素的遗传毒性作了研究。１．体外哺乳动物细胞（ＣＨＬ）染色体畸变试验。根据海南霉素的细胞毒性试验结果，设立以下剂量组①６～１８ｈ方案：１．６４、８．２０和１６．４０μｇ／ｍｌ；②２４～Ｏ和４８～０ｈ方案：０．０９５、０．１９０和０．９５０μｇ／ｍｌ。同时设溶剂和阳性对照。试验结果经Ｘ２检验为阴性。２．体外哺乳动物细胞（ＣＨＬ）姊妹染色单体交换试验，根据海南霉素的细胞毒性试验结果，设立以下剂量组：０．２、２．０、２０．０和３３．０μｇ／ｍ１。同时设溶剂和阳性对照。试验结果经ｔ检验为阴性。     

羔山羊卵巢卵母细胞体外成熟培养条件的研究

将出生后５０～７０日龄的羔山羊，经超数排卵处理以后，从卵泡中抽取卵母细胞，取外观形态正常的卵母细胞分成五组，在含有１０％胎牛血清（ＦＣＳ）的ＴＣＭ－１９９培养液中分别经１２、１６、１８、２０和２４ｈ的体外成熟培养后进行体外受精，探索不同体外成熟培养时间对体外受精及卵裂率的影响。另外，在成熟用培养基内还分别添加了发情母羊血清（ＥＮＧＳ）和ＦＣＳ以观察其培养效果。结果表明，经过１２～２４ｈ体外成熟培养的卵母细胞，在体外受精后的４８ｈ检查卵裂率分别为１０％、３７．１％、５０．０％，４１．２％和２５．０％，卵母细胞经体外成熟培养１６～２０ｈ的卵裂率显著高于１２ｈ和２４ｈ的卵裂率。在成熟培养基内分别添加ＥＮＧＳ和ＦＣＳ，其体外受精卵的卵裂率分别为６０．３和４６．８％，卵裂率在添加两种血清的培养基之间无显著差异。     

水牛巴贝斯虫病病原—牛巴贝斯虫体外培养的研究

本研究采用微气静相培养技术,对一株采自人工感染的去脾脏水牛犊的牛巴贝斯虫(Babesia bovis)进行了80天的连续体外培养·继代26次,累积增殖6.51×10~((?))倍;累积稀释2.19×10~(35)倍。培养24小时红细胞的染虫率为2.63±0.50％;48小时为7.18±1.39％;72小时为20.78±4 52％。最高红细胞染虫率达33.50％。体外培养的牛巴贝斯虫与采自病牛血液内的牛巴贝斯虫形态一致,说明已建立了水牛巴贝斯虫病病原——牛巴贝斯虫的体外培养。 对影响牛巴贝斯虫体外培养的几种因素进行的实验结果表明:培养液pH值显著地影响虫体的繁殖,最适的体外连续培养的pH为7.2;合适的血清浓度为40％;血清灭活后,支持牛巴贝斯虫生长繁殖的能力明显降低;脱纤血分离的血清和自然凝固血析出的血清用于培养的效果相同;RPMI-1640和TCM-199培养液支持牛巴贝斯虫生长繁殖的能力没有差异。     

屠宰绵羊卵巢卵母细胞的体外培养

为了使屠宰绵羊卵巢卵母细胞能够用于体外受精,本文着重探索了使卵巢卵母细胞体外培养成熟的方法和条件。实验结果表明,以TCM-199加10％FCS作为基本培养基,培养24～25小时,可以使绵羊卵巢卵母细胞培养成熟,其成熟率可达55.5％(435/784)。如果在培养液内添加hCG(0.02mg/ml)或LH(0.01mg/ml),并且尽可能保持卵丘细胞的完整,则可以使成熟率提高到76.9％(140/182)～82.9％(112/135)。