山羊卵母细胞的显微受精及胚胎培养

采用胞质内精子注射（ICSI）构建山羊显微受精胚，在两种培养液（CR1aa和SOFaa）与颗粒细胞共培养条件下，分别添加不同浓度的牛卵泡液（BFF）和胎牛血清（FBS），研究其对山羊卵母细胞显微受精胚体外发育的影响。结果表明：①在CR1aa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率最高（22．2％），显著高于添加5％（13．1％）和15％（2．7％）组。②在SOFaa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率（25．1％）显著高于添加5％（12．9％）和15％（3．0％）组。③在两种培养液中，分别添加10％BFF和10％FBS，ICSI胚的囊胚率分别为22．6％和26．9，5．8％和6．1％。表明：CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜山羊的1CSI胚体外培养；在早期胚胎培养中，添加10％BFF可显著提高ICSI胚的囊胚发育率：添加10％BFF比添加10％FBS对提高早期胚胎培养质量更为有效。     

ICSI介导生产转基因牛胚胎影响因素的研究

采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射（ICSI）介导转基因效果的影响。结果表明：线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组（19.8%,16.7%VS 7.9%,p〈0.05）。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率（24.7%）最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组（41%VS 20.5%,p〈0.01）;当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异（p〉0.05）,但二者之间胚胎的基因表达率差异显著（46.83%VS 28.57%,p〈0.05）。以上结果表明：（1）牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;（2）精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;（3）25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。     

奶牛X性控冻精的卵胞质内精子注射研究

探讨奶牛X性控冻精的卵胞质内单精子注射(ICSI)技术的可行性及显微操作条件对奶牛X性控冻精ICSI效果的影响.结果表明,注射运动性控冻精ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率均高于不运动组,但差异不显著(P>0.05).分别用5%、8%和10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的精子操作液处理性控冻精,进行ICSI操作,ICSI卵的卵裂率差异不显著;但PVP在5%和10%时,正常卵裂率分别是78.4%和69.1%(P<0.05),囊胚率分别是29.7%和20.4%(P<0.05).精子显微注射时,将卵母细胞的极体调整在相当于时钟6点与12点的位置时,所获ICSI卵的卵裂率差异不显著,但正常卵裂率(76.4%,66.7%)和囊胚率(28.6%,19.0%)明显提高(P<0.05).结论认为,进行奶牛X性控冻精ICSI操作时,应选用运动精子,并用含5%PVP的精子操作液进行处理,而且注射在卵母细胞极体置于6点的位置,有利于ICSI卵体外发育.     

小鼠极体重建卵母细胞的体外受精与发育

本实验分别以昆明系、ICR系和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系小鼠（即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠）为主要试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能。超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体（COCs）,利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体（PbI）;以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbI进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将PbI核供体注射到去核卵母细胞中,卵母细胞,进一步观察重建卵母细胞体外受精和体外培养发育能力。结果表明：注射hCG后12～14h回收的PbI活力最佳, 4℃条件下保存48h 后PbI仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重建卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎, 38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎。本研究初步证明小鼠第一极体重建卵母细胞可持续随后受精及其早期发育过程,为发掘和利用其它哺乳动物母本基因资源提供了参考依据。     

牛分离精子对体外受精的影响

本研究的目的是测定流动细胞分离仪的精子对牛卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响。共使用了4273个牛的卵母细胞和3种类型的精子（分离、染色未分离和未染色未分离）进行体外受精试验。这些精子分别来自于3头公牛，每头公牛重复试验3－5次，数据使用ANOVA程序进行统计分析。结果显示，用3种类型精子受精后的卵母细胞囊胚率无显著差异，分别为20．4％，22．62％和22．14％，但用分离精子受精后的卵裂率显著低于未分离的精子（53．66％比71．93％，P＜0．05）。所测度的3头公牛的卵裂率和囊胚率在不同公牛之间有所差异，H008号公牛所产生的囊胚明显低于H010号公牛组（分别为17．4％比25．1％，P＜0．05）。结果证明分离过程或染色并没有影响胚胎发育，流动细胞分离仪可以有效地用于牛胚胎的体外生产。此外，分离、染色未分离和未分离精子的受精和胚胎发育率，在不同公牛之间有差异的这一发现表明，选择能产生高质量精子的公牛精液进行精子分离，可以提高体外受精的效率。     

受精温度对牛卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响

将经过２０～２４ｈ体外成熟培养后的牛卵母细胞在含５％ＣＯ２，９５％空气，最大相对饱和湿度和温度分别为３７℃（Ｇ１），３８℃（Ｇ２）和３９℃（Ｇ３）的培养条件下进行体外受精，以观察受精温度对牛体外受精及其随后胚胎发育的影响。结果显示，不同受精温度对牛卵母细胞体外精子入卵率（９３．６％～１００％）及受精卵裂率（７８．５％～８０．３％）无明显影响；而早期胚胎卵裂发育速度、体外囊胚发育速度及体外囊胚发育率和孵化率均随着受精温度的升高呈上升趋势。在ＩＶＦ４２～４６ｈ，Ｇ３发育到５细胞以上卵裂周期阶段的早期胚胎比率（４０．３％）非常显著地高于Ｇ２（２４．３％）和Ｇ１（１８．８％，Ｐ＜０．００１）；而相应处于２细胞阶段的胚胎比率（Ｇ３为１４．６％）则十分显著地低于Ｇ２（２５．２％）和Ｇ１（３０．１％，Ｐ＜０．０１）。Ｇ３的囊胚体外孵化率（７５．８％）也非常明显地高于Ｇ２（５１．９％）和Ｇ１（４７．９％，Ｐ＜０．００）。结果表明，受精温度（３７～３９℃）主要影响早期胚胎的质量，从而影响到其随后的囊胚发育率、发育速度及其孵化率，而对卵母细胞的受精、卵裂率无明显影响。     

不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响

本研究探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。水牛体外成熟卵进行ICSI介导转基因（ICSI—mediatedgenetransfer。ICSI．Tr）操作后，先用5ixmol／L的离子霉素（ionomycin，Ion）激活处理5min，然后分成3组，再分别用10μg／mL放线菌酮（cycloheximide，CHX）培养5h（CHX5h组）、10μg／mLCHX培养3h后再用2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养2h（CHX3h-DMAP2h组）或用培养液（CM）培养3h后再用2mmol／L6-DMAP培养2h（CM3h．DMAP2h组）。结果显示，CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率和囊胚发育率最高，且显著高于CM3h．DMAP2h组（66．7％比49．5％，p〈0．05；66．7％比40．0％，p〈0．01；22．2％比9．9％，p〈0．05）。ICSI18h后检查原核形成率，发现CHX5h和CHX3h．DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组（p〈0．05），2原核（pronucleus，PN）百分率则显著提高（42．4％比23．8％，p〈0．05；44．6％比23．8％，p〈0．01）。以上结果表明，在水牛ICSI介导转基因时，Ion联合CHX较Ion联合6-DMAP激活重构胚效果好。     

小鼠极体重组卵母细胞的体外受精与发育

分别以昆明系、ICR系、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系(即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠)和无标记C57BL/6J系小鼠(Mus musculus)为试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能.超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs),利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体(Pb Ⅰ);以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbⅠ进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将Pb Ⅰ核供体注射到去核卵母细胞中,进一步观察重组卵母细胞体外受精和体外培养发育能力.结果表明,注射hCG后12～14 h回收的Pb Ⅰ活力最佳,4℃条件下保存48 h后Pb Ⅰ仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重组卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎,38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎.初步证明小鼠第一极体重组卵母细胞可体外受精和体外早期发育,为发掘和利用家畜母本基因资源提供了参考依据.     

两种激活处理促进小鼠孤雌胚胎原核形成

不同人工处理方法激活哺乳动物卵母细胞的机理相似,但其激活效率存在差异。本研究以昆明（KM）、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1雌鼠来源的卵母细胞为对象,利用氯化锶（SrCl2,Sr2＋）联合细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）（Sr2＋＋CB）和离子霉素（ionomycin,Ion）联合6-二甲胺基嘌呤（6-dimethylaminopurine,6-DMAP）（Ion＋6-DMAP）两种激活方法处理下对比分析不同品系小鼠卵母细胞的激活效率,并以卵母细胞原核形成率、原核数量和孤雌胚胎体外发育来评价两种激活剂的激活效率。研究结果表明,Ion＋6-DMAP激活卵的1原核比率显著高于2原核（p〈0.05）,Sr2＋＋CB激活卵的2原核比率显著高于1原核（p〈0.05）;KM、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1各组孤雌胚胎卵裂率和激活率没有显著差异（P〉0.05）,但129/Sv×KM F1和C3H×KM F1囊胚发育率显著高于KM组（p〈0.05）。3种小鼠品系的卵母细胞用Sr2＋＋CB处理的孤雌胚胎发育率显著高于Ion＋6-DMAP。结果证明,Sr2＋＋CB处理小鼠卵母细胞的激活效率明显优于Ion＋6-DMAP;129/Sv×KM F1和C3H×KM F1的孤雌胚胎体外发育率显著高于KM小鼠,为研究小鼠遗传背景影响孤雌胚胎发育的机理提供参考。     

兔和牛卵母细胞核移植的研究

通过显微操作，将１６～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙内，用适当电压（兔１６０Ｖ、牛１２０Ｖ）和脉冲时间的两次电脉冲诱导卵裂球与卵母细胞的融合；融合后的胚胎体外培养观察发育或移植到同步受体。体内成熟的免卵母细胞操作后存活率为９３．７％（１５０１／１６０２），融合率为９４．３％（１２８１／１３５９）。融合卵再用１６０Ｖ４０μｓ电脉冲电激一次，可显著提高其卵裂率（７５．９％比１８．２％，Ｐ＜０．０１）。用体外成熟的兔卵母细胞进行核移植，存活率和融合率分别为７８．５％（９５／１２１）和９５．７％（８８／９２），融合胚卵裂率为５１．４％（３７／７２）。初步表明体外成熟的兔卵母细胞可作为核移植的受体卵。此外，还尝试了用体外受精的牛胚胎和体外成熟的牛卵母细胞进行核移植，操作后存活率和融合率分别为９８．０％（５０／５１）和７５．５％（３７／４９），核移植胚的卵裂率为５４．１％（２０／３７）。     

水牛和黄牛种间体外受精的研究

将从屠宰母牛卵巢上采集的水牛和黄牛的卵母细胞经 2 0～ 2 4 h体外成熟培养后 ,分别用么拉水牛或奶牛精液进行种间和种内体外受精。受精卵在体外条件下继续培养到囊胚和孵化囊胚阶段。结果表明 ,用黄牛精子受精水牛卵母细胞 (黄×水 )或用水牛精子受精黄牛卵母细胞 (水×黄 )的种间体外受精均有较高的卵裂率 (分别为 4 6.5%和 68.4 % )。但其体外囊胚发育率分别只有 3.5%和 8.7% ,显著低于种内受精组(水×水组为 1 9.9% ,黄×黄组为 2 8.0 % ,P<0 .0 5)。在受精后 2 0 h对受精卵进行固定、染色 ,发现种间受精的黄×水和水×黄组 ,分别有 36.8%和 75.0 %的受精卵形成有 1个以上原核 ,且这些受精激活卵中大部分含 2个原核以上 (分别为 80 .9%和 80 .0 % ) ,说明种间受精的精子已进入到卵母细胞内受精并形成了雄性原核。     

卵母细胞胞浆内精子注射(ICSI)技术的研究进展

利用人工辅助的显微操作技术,直接将精子注射至成熟卵母细胞质的方法,称为胞浆内精子注射技术,简称ICS I(in tracytop lasm ic sperm in jection)技术。目前,该项技术已经成功地用于生产试管婴儿、研究哺乳动物的受精机理、动物转基因、家畜性控胚胎生产等领域。本文详述了ICS I技术体系的发展背景、现状及其应用等方面。     

受精液、咖啡因、精液和抗菌素对猪卵母细胞的体外受精及早期胚胎发育的影响

探讨精液的不同处理、抗菌素、受精液种类和咖啡因对体外成熟猪卵母细胞的体外受精和早期胚胎发育的影响。结果表明：(1)受精液中抗菌素添加与否对体外成熟猪卵母细胞的体外受精无显著影响，而且不添加抗菌素的受精液也无严重微生物污染；(2)用猪冷冻精液与新鲜精液进行猪卵母细胞的体外受精对早期胚胎发育无显著影响；(3)在受精液mTBM中添加5mmol／L咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的早期发育是最好的；(4)用mTBM进行猪卵母细胞体外受精的卵裂率明显高于用mBO进行体外受精的卵裂率，但其第8d囊胚率明显低千用mBO进行体外受精的，mTBM和mBO各有优势；(5)在洗精子液含有高浓度咖啡因(15mmol／L)的情况下，无咖啡因的受精液也可进行猪卵母细胞的体外受精并发育到囊胚阶段，在受精液中添加不同浓度(0～10mmol／L)的咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的卵裂率和第8d囊胚率都无显著影响，受精液中咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的第6d桑椹胚 囊胚率的影响因浓度而异．其中以添加5mmol／L为最佳，随着浓度上升效果开始下降。     

山羊-绵羊异质体细胞克隆胚中线粒体DNA的杂合性分析

摘要：线粒体是哺乳动物细胞中唯一存在有核外遗传物质的细胞器，其功能的正常表达需要核与线粒体的相互作用。线粒体 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)编码电子传递链所需酶中的一些多肽亚基及多种 tRNA 和 rRNA，其余的亚基由核基因编码。异种体细胞核移植可能导致重构胚中 mtDNA 的杂合现象。本实验采用 PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）的方法分析以山羊胎儿成纤维细胞为核供体，以去核的绵羊 MⅡ 期卵母细胞为核受体构建的异质克隆胚中线粒体的来源及组成比例。结果表明： 8-cell之前的异质克隆胚中供受体 mtDNA 的比例变化不大，1-cell、2-cell、4-cell、8-cel异质克隆胚中核供体细胞 mtDNA 占受体细胞 mtDNA 的比例分别为2.5±0.8 %；2.8±0.6 %；1.9±0.4 %；1.7±0.6 %， 彼此之间差异不显著（P>0.05）；然而，异质克隆囊胚中核供体细胞 mtDNA 的比例下降为0.3±0.1 %，与前四者相比差异显著（P<0.05）。     

不同精子处理对应用ICSI—Tr技术生产转基因水牛胚胎效率的影响

本文主要探讨了不同精子处理对应用显微授精介导（intracytoplasmic sperm injection-mediatedtrans-genesis,ICSI-Tr）生产转基因水牛胚胎效率的影响。本试验以p18T—BCN5．2-IFN-1．1pA—EGFP为载体,比较了精子的不同处理方式（NaOH和冻融）、NaOH处理精子不同时间（5min,10min,20min,30min和60minl以及不同外源DNA浓度（5ng／μL,10ng／μL,25ng／μL和50ng／μL）对ICSI-Tr转基因效率的影响。结果显示：NaOH处理组的囊胚EGFP表达率（46．1％）,与冻融精子处理组（47．1％1差异不显著,但发育率显著高于冻融处理精子组（28．3％VS16．7％,P〈0．05）。处理60min组和30min组的分裂率分别为78．9％和77．5％,显著高于20min、10min和5min组的64．0％、60．0％和64．0％（P〈0．05）,其中30min处理组的囊胚EGFP表达率高达44．4％,显著高于其它处理组（P〈0．05）。25ng／μL组和50ng／μL组的早期胚胎EGFP表达效率差异不显著（41．3％VS42．5％）,但显著高于5ng／肚组和10ng／μL组（22．5％和35．5％）,25ng／μL组的囊胚EGFP表达效率显著高于其它组（P〈0．05）。本研究优化了应用ICSI-Tr生产转基因水牛胚胎技术体系,为获得ICSI-Tr转基因水牛奠定了良好的工作基础。     

血清添加时间及胚胎培养模式对产业化生产牛胚胎的影响

在利用体外受精技术产业化生产牛胚胎的体系中,体外受精卵一开始就培养在已加入犊牛血清（FBS）的改良SOF液的实验组,其卵裂率（80.6%,253/314）和可冷冻胚胎率（20.8%,129/620）与在体外受精（IVF）3 d后才往胚胎培养体系中加入FBS的结果差异不显著（相应为83.4%,262/314和24.4%,151/620,P〉0.05）;而囊胚率差异显著（分别为41.8%,259/620和 48.5%,301/620,P〈0.05）.在IVF后第3天将培养体系中的未受精卵及发育迟缓的2-细胞阶段胚胎剔除与否的不同胚胎培养模式对其后囊胚的产量和质量均无显著影响.