含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术,在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因,暂命名为TaCDCP1(Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框,编码217个氨基酸。推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域,不含跨膜区且无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中;在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤,乙烯,赤霉素,茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升,在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。这些结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。     

条锈菌诱导的小麦MBF1转录辅激活因子基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中分离出一个条锈菌诱导的编码MBF1基因的cDNA序列,暂被命名为TaMBF1a。TaMBF1a包含一个完整的429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸,具有MBF1保守结构域;小麦TaMBF1a氨基酸序列与水稻OsMBF1相似性达92%,与拟南芥AtMBF1a相似性达80%。TaMBF1a编码的蛋白可能是核蛋白,且该基因在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaMBF1a基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合。外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸也可诱导该基因快速上调表达,表明TaMBF1a可能通过水杨酸、乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应。     

小麦脂质转运蛋白基因TaLTP克隆及功能分析

脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)是广泛存在于植物中的一类小分子蛋白,因其能在植物细胞膜间运输脂类物质而得名,在植物角质层合成和适应多种环境胁迫中起重要作用。本研究利用同源克隆方法得到Ta LTP-s的c DNA全长序列510 bp,开放阅读框为339 bp,编码112个氨基酸。利用RIL群体将Ta LTP-s定位在染色体1A上,距离两侧标记WMC449和WMC93的遗传距离分别为2.1 c M和5.9 c M。通过原生质体亚细胞定位显示Ta LTP-s定位于细胞膜和细胞质中。小麦开花期Ta LTP-s在小花中表达量较高,尤其是在花药中的表达量远高于在根和叶中。在ABA、PEG、Na Cl及4℃低温胁迫诱导下,小麦Ta LTP-s均上调表达,可能与抗逆性调节相关。在高盐胁迫处理下,转基因拟南芥幼苗的细胞膜稳定性和存活率显著高于野生型。研究结果为利用小麦脂质转运蛋白基因改良作物抗逆性奠定了基础。     

小G蛋白Rab2基因参与小麦抗叶锈病反应的研究

为了解叶锈菌侵染小麦后小G蛋白Rab2基因的表达情况,明确其与抗病性的关系,从分子水平上探讨小麦的抗叶锈病机制。以普通六倍体小麦近等基因系TcLr1和叶锈菌小种05-22-64①和05-8-63①为试验材料,构建小麦亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦小G蛋白Rab2基因的表达情况进行检测。结果表明:在小麦叶锈菌侵染过程中,Rab2基因主要在侵染的前期表达迅速,随着时间的推移表达量有所下降。非亲和叶锈菌菌株可以诱导小G蛋白Rab2基因表达量的升高,而亲和叶锈菌菌株抑制小G蛋白Rab2基因的表达。由此表明,小G蛋白可能与寄主和病原物的亲和程度有着直接的关系。     

小麦钙调素新亚型TaCaM5的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术,从条锈菌诱导的小麦叶片中分离出一个编码CaM基因的cDNA序列, 经氨基酸序列分析确定其为一个新的小麦CaM亚型,暂被命名为TaCaM5。TaCaM5包含一个完整450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸;编码的蛋白不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,具有4个EF-hand保守结构域。在目前已知的CaM基因中,TaCaM5与玉米CaM基因的亲缘关系最近,相似性高达97%。该基因在根、茎、叶等组织中均有不同程度的表达;并且受条锈菌诱导表达,在非亲和组合与亲和组合中,分别在接种后6 h和24 h表达量最高。外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯诱导TaCaM5上调表达,水杨酸诱导其下调表达。TaCaM5在机械伤害、干旱和低温条件下表达量上升,在高盐环境下表达量降低。表明TaCaM5可能通过茉莉酸和乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与机械伤害、低温和干旱环境下的Ca²⁺-CaM信号转导途径。     

TaCDPK2基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达分析

在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从叶锈菌侵染的小麦叶片中发现在接种后8 h表现高表达量的CDPK2-EST。CDPKs即钙离子依赖蛋白激酶,是植物细胞应对各种生物和非生物胁迫过程中承接Ca2+流变化的重要因素。为进一步研究CDPK2在小麦与叶锈菌互作过程中的表达特性,采用RT-PCR和Western-Blotting技术分别在mRNA水平和蛋白质水平对小麦受叶锈菌侵染后不同亲和性组合中CDPK2的表达谱进行了检测。结果表明,小麦CDPK2基因受叶锈菌侵染诱导,不亲和组合在接种后4 h无论在mRNA水平还是蛋白质水平该基因均表现上调表达,而转录水平的表达量在接种后16 h降至对照水平;而在蛋白水平其表达量在接种16 h达到最大,之后又恢复至对照水平。亲和组合中该基因在接种后8 h在mRNA水平略有表达,在蛋白水平其表达量在接种后8 h和16 h有上调表达但其表达量低于不亲和组合,之后又趋于对照水平。这一结果表明,小麦CDPK2基因参与了小麦与叶锈菌的互作过程,并在该过程中对提高小麦抗叶锈能力有一定作用。这一结果为深入探讨小麦CDPK2基因在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用及作用机制奠定了基础。     

小麦条锈菌诱导性小麦cDNA文库的构建及其质量评价

小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)侵染引起的世界性气传叶部病害之一,在我国发生尤为普遍而严重,是小麦(Triticum aestivum L.)生产上最重要病害,克隆并研究小麦抗条锈病相关基因的生物学功能具有重要的应用价值和现实意义.在本研究中用中国当前毒性最强优势条锈菌小种CY32侵染诱导的小麦抗条锈病基因Yr5近等基因品系Taichung29*6/Yr5为试材,构建非亲和条锈菌小种侵染诱导的小麦cDNA文库.研究结果表明所获得的原始文库滴度0.9x106 pfu/mL,扩增文库滴度1.0x109pfu/mL,重组率98%,插入片段在0.5 kb到3.0 kb之间,多在1.0 kb左右.因此该文库可用于基因克隆与分析,为研究小麦抗条锈病相关基因提供条件.     

小麦抗条锈病基因的研究进展

条锈病是由条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起的我国最重要的小麦病害之一,由于小麦条锈菌的高度变异性,加之大面积种植单一抗病品种,致使其丧失原有抗性.因此抗小麦条锈病基因的研究在小麦抗病品种选育中起到举足轻重的作用.本文通过对小麦抗条锈病基因的来源,基因定位,分子标记,基因克隆,基因聚合等方面进行阐述,为小麦抗条锈病育种提供理论依据.     

小麦G2-like转录因子家族基因鉴定与表达模式分析

Golden2-Like (G2-like)转录因子,是属于MYB类转录因子中GARP超家族的成员,在调节叶绿体发育中起重要作用。本研究利用生物信息学方法对小麦G2-like基因进行了全基因组鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位、启动子顺式作用元件及对非生物胁迫和激素的响应模式进行了分析。从小麦中共鉴定出87个G2-like基因,不均匀的分布在小麦21条染色体上,系统发育分析将这些基因分为14个亚族。蛋白质二级结构预测表明,小麦G2-like基因的氨基酸序列均以α螺旋和随机卷曲为主要结构。启动子顺式作用元件分析表明其上游2 kb区域含有7种(P-box、SpI、LTR、ABRE、MBS、TGA-element和AE-box)与逆境胁迫诱导相关顺式作用元件。其中Ta3AG2-like19含有顺式调控元件结合位点最多,一共有18个结合位点。qRT-PCR验证发现,Ta3AG2-like19、Ta3AG2-like20、Ta4AG2-like29和Ta6AG2-like52在PEG和盐胁迫下以及GA、IAA和ABA激素诱导下表达量显著上调,这些基因可能介导了小麦对多种非生物逆境的响应。     

小麦TaPOD家族的全基因组鉴定及表达分析

过氧化物酶(Peroxidase, POD)家族成员在调节植物生长发育和响应逆境胁迫中起重要作用。为系统探究小麦(TriticumaestivumL.)TaPOD基因家族的功能及其表达模式,本研究利用生物信息学的方法鉴定了小麦TaPOD基因家族成员,对其理化性质、启动子顺式作用元件、进化特征做了预测分析,并通过小麦转录组和实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative, RT-qPCR)分析了其在不同组织、外源激素及逆境胁迫下的表达模式。结果表明,目前基因组测序小麦中包含659个TaPOD基因家族成员,蛋白质序列长度在206～518个氨基酸之间;系统发育分析表明,小麦TaPOD家族成员分为I～VII组且每组成员数量不等;序列比对显示小麦TaPOD家族成员具有5个保守基序,且基因结构等方面存在很大差异,预示着功能存在多样性;染色体定位发现其数量在小麦的21条染色体上分布不均匀,其中2B染色体上数量最多;通过种内共线性分析发现,小麦TaPOD基因共有396个重复事件,同源性较高且进化过程非常保守,主要通过片段复制和串联复制进行扩增,且Ka/Ks比率显示仅有4对家族成员受到...     

小麦外源抗条锈病基因及染色体定位研究进展

小麦条锈病(Wheat stripe rust or yellow rust)是小麦生产中重要流行病害之一。挖掘抗病基因,培育抗病品种是防治该病害最有效的措施。中国小麦条锈菌抗源单一,且具高度变异性,抗病品种极易丧失抗性。不断挖掘,筛选新的抗条锈病基因,对中国小麦抗病育种工作极为重要。小麦抗条锈病基因主要来源于普通小麦和小麦近缘属植物,而小麦近缘属植物蕴含丰富的抗病基因。本综述主要对目前已正式命名的,暂命名的外源抗条锈病基因进行总结,并对其染色体具体位置分布进行归纳,对优异抗病资源利用进行简要分析和展望,以期在育种工作中进一步高效利用外源抗条锈病基因。     

小麦与叶锈菌互作体系中G蛋白α、β亚基的表达及其与抗病蛋白和活性氧代谢的关系

为了从基因表达水平和抗病生理水平上了解小麦与叶锈菌互作过程中G蛋白的α、β亚基的作用,进一步揭示小麦的抗叶锈病分子机制和信号转导途径,以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr1和叶锈菌05-22-64/05-8-63①为材料,构建了小麦与叶锈菌互作的亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦G蛋白α、β亚基的基因表达量进行了检测。另外,以清水为对照,检测亲和与非亲和互作组合中,以及G蛋白抑制剂百日咳毒素PTX处理后再接种无毒性菌株的处理中,几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶以及活性氧产生速率的变化。结果发现,G蛋白的α亚基和β亚基都参与了小麦抗叶锈病的反应,并且可能在信号传递过程中起重要作用。无毒性叶锈菌可诱导G蛋白基因表达量的升高,而毒性叶锈菌会抑制G蛋白基因的表达。G蛋白α、β亚基在抗病反应信号传递过程中先后次序不同,β亚基基因的表达先于α亚基基因且表达量高于α亚基基因。另外,G蛋白可能通过诱导防卫酶和活性氧产生的增加来提高小麦对叶锈病的抗性。     

利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因

为了鉴定可能的小麦抗光氧化基因,利用大麦条斑病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统,对6个小偃54响应强光的基因进行了沉默表达研究。以BSMV:GFP植株为对照,分析了这些基因的减量表达植株在低温强光、DCMU、MV及H₂O₂等处理下的PSI最大光化学效率(F_v/F_m)和光合性能指数(P.I.)、MDA含量及整株生物量变化。结果显示,Ta23008和Ta92165均参与小麦对低温强光、DCMU、MV和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta106078参与小麦对DCMU、MV和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta27787参与小麦对低温强光、DCMU和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta24695参与小麦对低温强光和H₂O₂胁迫的响应过程;而Ta119251仅参与小麦对DCMU的响应过程。此外,Ta23008、Ta92165、Ta106078、Ta119251四个基因被抑制表达后,其转化株系的生物量比对照显著降低,推测其可能参与调控小麦生物量的积累。     

Ca2+·CaM信使系统参与小麦抗叶锈病反应的初步研究

研究Ca2+.CaM是否参与小麦抗叶锈病反应的过程,为更深入了解小麦抗叶锈病的反应机制奠定基础。采用离体培养的方法测定小麦种子经CaM拮抗剂TFP(三氟拉嗪)、CPZ(氯丙嗪)和W-7(N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalene sulfonamide)以及CaCl2预处理后小麦叶片接种叶锈菌后在不同时间点的酶活性。另外用实时定量PCR的方法检测小麦接种亲和小种和非亲和小种后CaM不同亚型基因的表达情况。试验结果表明:小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后,TFP、CPZ和W-7浸种处理抑制了过氧化物酶(POD)、丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)活性的上升;小麦叶片接种亲和性叶锈菌后,CaCl2预处理加剧了过氧化物酶(POD)、丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)活性的上升。这说明Ca2+.CaM信使系统可能在小麦抗叶锈病过程中起着重要作用,并且不同的CaM亚型可能调控不同的抗病途径。     

青藏春冬麦区93份小麦地方种质条锈病抗性评价及抗病基因分子鉴定

为应对当前条锈菌强毒性小种对中国小麦生产带来的威胁,本研究通过鉴定来自青藏春冬麦区的93份小麦地方种质对中国当前条锈菌流行小种或致病类群在苗期和成株期的抗性水平,检测其可能携带的条锈病抗性基因,为培育小麦抗条锈病新品种提供抗源。利用条锈菌流行小种条中32号(CYR32)和条中34号(CYR34)对93份来源于青藏春冬麦区小麦地方品种进行温室苗期抗性鉴定,并于2015—2016、2017—2018和2018—2019年度在四川崇州和绵阳共4个田间环境下,利用由条锈菌流行小种(CYR32、CYR33、CYR34)、水源致病类型(Su11-4、Su11-5)、贵农22致病类型(G22-14)组成的混合菌进行成株期抗性鉴定。同时利用Yr5、Yr10、Yr18、Yr24 (=Yr26)、Yr48、Yr65和Yr67共7个已知抗条锈病基因紧密连锁的侧翼分子标记或功能标记进行检测。抗性鉴定结果表明, 4份(占4.30%)种质对CYR32表现苗期抗性; 3份(占3.26%)对CYR34表现苗期抗性;其中1份种质(白颖无芒小麦)对CYR32和CYR34均表现苗期抗性。10份种质(占10.75%)在4个田间环境中均表现成株期抗性。分子检测结果表明,可能携带Yr18、Yr48和Yr65的种质分别有11份、40份和1份。其中, 7份可能同时携带Yr18+Yr48基因; 3份未检测出供试已知Yr基因,推测其可能携带其他已知或未知条锈病抗性基因。上述研究结果表明,青藏春冬麦区小麦地方种质对中国当前条锈菌流行小种或致病类群的抗性整体水平较低,其携带抗性基因的多样性也较低;建议对表现良好抗性且可能携带未知抗性基因的地方种质进行发掘并利用其加快育种。     

乌拉尔图小麦WRKY转录因子的筛选与分析

WRKY转录因子广泛参与植物抗逆胁迫反应,全面分析挖掘小麦A染色体组供体物种乌拉尔图小麦中的WRKY转录因子,对进一步挖掘分析六倍体小麦WRKY转录因子的分子功能具有重要意义。本研究通过生物信息学分析,在乌拉尔图小麦基因组数据中鉴定得到62条全长WRKY转录因子,其中14条能被准确定位在染色体上,并发现2对WRKY转录因子发生了复制;通过进化树分析,发现62条WRKY转录因子被分为8个小亚族,且小亚族内部的基因结构相对保守。通过荧光定量分析所选基因在非生物胁迫下的表达模式,筛选到2条在不同非生物胁迫下均上调表达的WRKY转录因子,为进一步分析其功能打下基础。     

小麦bZIP家族转录因子的鉴定及其在盐胁迫条件下的表达分析

b ZIP (Basic region/leucine zipper motif)蛋白是真核生物中普遍存在的一类转录因子,对植物应答胁迫具有重要作用。为了鉴定bZIP家族转录因子基因是否参与小麦盐胁迫响应的调控过程,获得更多与盐胁迫相关的b ZIP转录因子,本研究以‘科农199’(KN199)为实验材料,利用Illumina HiSeq平台进行150 bp双端测序,从转录组水平检测了bZIP家族转录因子基因在小麦盐胁迫条件下的差异表达情况。结果显示,每个处理的生物学重复之间的相关系数都在0.97以上,说明本实验中样品重复性较好,在处理不同时间点样品间的差异非常显著。根据中国春(Chinese spring, CS)参考基因组筛选到的156个小麦bZIP家族转录因子中,有14个bZIP转录因子位于5B染色体上;经盐处理1 h后,鉴定出14 544个差异表达基因(DEGs),包括49个b ZIP转录因子基因;在处理6 h后,鉴定出25 546个DEGs,包括59个bZIP转录因子基因,并且b ZIP转录因子基因在两组样品之间有35个共同的DEGs,其中有25个基因上调表达,10个基因下调表达。小麦响应盐胁迫b ZIP转录因子基因进行聚类分析结果与基因表达差异的结果一致。研究发现不论是总的DEGs还是差异表达的bZIP转录因子基因的数目,均随着处理时间的延长而增加,推测这些基因可能参与调控小麦盐胁迫反应。     

条锈菌诱导的小麦bZIP转录因子基因的克隆及表达分析

采用电子克隆和RT-PCR方法,从条锈菌诱导的小麦品种水源11的cDNA中分离到一个编码bZIP转录因子基因的cDNA序列,暂被命名为TabZIP。TabZIP包含一个完整的1 071 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域;与水稻、玉米、拟南芥等植物bZIP蛋白的氨基酸序列相似性较高;TabZIP基因在小麦根中的表达量丰富,而在茎和叶中表达量很小;在小麦与条锈菌非亲和组合中,TabZIP基因高水平表达,而在亲和组合中没有明显的变化;防卫相关激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因的快速上调表达,表明TabZIP可能通过乙烯、茉莉酸信号途径介导小麦对条锈病的防御反应。     

小麦条锈病抗性基因研究进展及在育种中的应用

概述了已知小麦条锈病抗性基因的来源、染色体定位和分子标记研究现状,回顾了抗性品种与生理小种的演变,评价了小麦抗条锈基因,并浅谈了小麦抗条锈基因的分子标记在育种中的应用     

外源ABA对干旱胁迫下不同品种灌浆期小麦psbA基因表达的影响

脱落酸(abscisic acid, ABA)是一种重要的植物激素,与作物的抗干旱胁迫密切相关。本试验以灌浆期的豫麦949和陕麦5号小麦品种为试材,PEG干旱处理72 h后,比较了脱落酸对小麦相对水分含量、叶绿素、丙二醛含量以及产量的影响,并采用反转录半定量PCR方法测定PSII中psbA基因转录水平的变化。结果表明,干旱胁迫明显降低小麦叶片中相对水分和叶绿素含量,增加丙二醛含量,抑制psbA基因的转录,降低小麦的产量,而外源脱落酸能明显缓解这些胁迫反应。与豫麦949相比,陕麦5号中质膜损伤较小,相对水分和叶绿素含量、产量以及psbA基因转录水平的下降也较小,外源脱落酸处理后,各参数也能够恢复到对照水平,说明不同小麦品种的抗干旱胁迫能力与psbA基因的表达水平密切相关。本试验的研究结果也首次发现了外源ABA能够调控干旱胁迫下灌浆期小麦psbA基因的表达,稳定PSII系统中重要基因的转录水平,从而提高灌浆期小麦的抗干旱胁迫能力。