CaM及各亚型基因参与小麦抗叶锈病反应的研究

采用实时荧光定量PCR法,对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr15接种亲和或非亲和性叶锈菌后,CaM及其亚型的mRNA表达差异进行相对定量分析.结果表明,小麦接菌后12 h内CaM 的4个亚型基因表达量与不接菌对照相比相差不大.小麦接种非亲和叶锈菌,48,72,96 h后,CaM SF-1表达量分别比亲和组合高 24.6%,26.6%,38.8%;接种24,48 h后,CaM SF-4表达量分别高出亲和组合26.8%和28.0%;在接种后24~96 h这一过程中,CaM SF-2表达量均低于亲和组合中, 而CaM SF-3表达量与亲和组合表达量相差不大.接种非亲和叶锈菌后,在第24 h 、第 48 h小麦CaM表达量分别高于亲和组合18.1% 和 47.9% ,而在第72 h和第96 h CaM表达量又低于亲和组合.上述结果暗示,CaM可能参与了小麦抗叶锈病反应,并且具有亚型特异性.小麦中CaM SF-1和 CaM SF-4可能与小麦抗叶锈病相关,CaM SF-2可能与小麦感叶锈病相关,而CaM SF-3可能不参与小麦抗叶锈病反应.     

含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术,在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因,暂命名为TaCDCP1(Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框,编码217个氨基酸。推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域,不含跨膜区且无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中;在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤,乙烯,赤霉素,茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升,在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。这些结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。     

小G蛋白Rab2基因参与小麦抗叶锈病反应的研究

为了解叶锈菌侵染小麦后小G蛋白Rab2基因的表达情况,明确其与抗病性的关系,从分子水平上探讨小麦的抗叶锈病机制。以普通六倍体小麦近等基因系TcLr1和叶锈菌小种05-22-64①和05-8-63①为试验材料,构建小麦亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦小G蛋白Rab2基因的表达情况进行检测。结果表明:在小麦叶锈菌侵染过程中,Rab2基因主要在侵染的前期表达迅速,随着时间的推移表达量有所下降。非亲和叶锈菌菌株可以诱导小G蛋白Rab2基因表达量的升高,而亲和叶锈菌菌株抑制小G蛋白Rab2基因的表达。由此表明,小G蛋白可能与寄主和病原物的亲和程度有着直接的关系。     

小麦与叶锈菌互作体系中G蛋白α、β亚基的表达及其与抗病蛋白和活性氧代谢的关系

为了从基因表达水平和抗病生理水平上了解小麦与叶锈菌互作过程中G蛋白的α、β亚基的作用,进一步揭示小麦的抗叶锈病分子机制和信号转导途径,以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr1和叶锈菌05-22-64/05-8-63①为材料,构建了小麦与叶锈菌互作的亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦G蛋白α、β亚基的基因表达量进行了检测。另外,以清水为对照,检测亲和与非亲和互作组合中,以及G蛋白抑制剂百日咳毒素PTX处理后再接种无毒性菌株的处理中,几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶以及活性氧产生速率的变化。结果发现,G蛋白的α亚基和β亚基都参与了小麦抗叶锈病的反应,并且可能在信号传递过程中起重要作用。无毒性叶锈菌可诱导G蛋白基因表达量的升高,而毒性叶锈菌会抑制G蛋白基因的表达。G蛋白α、β亚基在抗病反应信号传递过程中先后次序不同,β亚基基因的表达先于α亚基基因且表达量高于α亚基基因。另外,G蛋白可能通过诱导防卫酶和活性氧产生的增加来提高小麦对叶锈病的抗性。     

小麦单基因系TcLr19抗叶锈防卫反应的表达与叶锈菌侵染进程关系的初步研究

试验采用小麦单基因系TcLr19,感病对照Thacher(Tc)及叶锈菌小种366和165,利用组织化学方法,对接种后不同时间点叶锈菌在亲和和不亲和寄主上的发育情况进行观察,并对表现不同侵染型的TcLr19-叶锈菌组合中的2种防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(PO)的活性变化及发生过敏性死亡(HR)的细胞面积进行测定.结果表明,伴随着叶锈菌的侵染,TcLr19接种叶锈菌小种366(侵染型为0;)后PAL的活性分别在24,72 h出现高峰,PO活性在48 h达到最高峰,发生HR的细胞面积从接种后24 h逐渐增加直至96 h达到高峰;而接种叶锈菌小种165(侵染型为1)后2种酶活性变化及HR的变化和接种366具有相同趋势,但是前者的酶活性峰值低于后者,且发生HR的面积在96 h之前一直也小于后者.小麦对叶锈菌的抗性表达程度与防卫反应的表达强度呈正相关关系.     

TaRanGAP2在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用

为研究TaRanGAP2在小麦抵抗叶锈菌侵染的HR诱发中的作用,阐明小麦抗叶锈病分子机制,为小麦抗叶锈病育种给予分子水平的指导.以小麦近等基因系TcLr26及其轮回亲本Tc分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和组合(TcLr26×260)及亲和组合(Tc×260),生物信息学分析发现,TaRanGAP2的CDS全长为16...     

条锈菌诱导的小麦MBF1转录辅激活因子基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中分离出一个条锈菌诱导的编码MBF1基因的cDNA序列,暂被命名为TaMBF1a。TaMBF1a包含一个完整的429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸,具有MBF1保守结构域;小麦TaMBF1a氨基酸序列与水稻OsMBF1相似性达92%,与拟南芥AtMBF1a相似性达80%。TaMBF1a编码的蛋白可能是核蛋白,且该基因在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaMBF1a基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合。外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸也可诱导该基因快速上调表达,表明TaMBF1a可能通过水杨酸、乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应。     

河北省又取得一批植保农药类科研成果

<正>(接上期)5.钙调素在小麦受叶锈菌侵染诱发的过敏性反应中的作用单位名称:河北农业大学评价单位名称:河北省教育厅该研究以小麦-叶锈菌互作体系为研究对象,利用小麦品种洛夫林10分别和叶锈菌生理小种260、165组成不亲和组合和亲和组合,试图查明CaM是否参与小麦抵抗叶锈菌     

小麦钙调素新亚型TaCaM5的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术,从条锈菌诱导的小麦叶片中分离出一个编码CaM基因的cDNA序列, 经氨基酸序列分析确定其为一个新的小麦CaM亚型,暂被命名为TaCaM5。TaCaM5包含一个完整450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸;编码的蛋白不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,具有4个EF-hand保守结构域。在目前已知的CaM基因中,TaCaM5与玉米CaM基因的亲缘关系最近,相似性高达97%。该基因在根、茎、叶等组织中均有不同程度的表达;并且受条锈菌诱导表达,在非亲和组合与亲和组合中,分别在接种后6 h和24 h表达量最高。外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯诱导TaCaM5上调表达,水杨酸诱导其下调表达。TaCaM5在机械伤害、干旱和低温条件下表达量上升,在高盐环境下表达量降低。表明TaCaM5可能通过茉莉酸和乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与机械伤害、低温和干旱环境下的Ca²⁺-CaM信号转导途径。     

条锈菌诱导的小麦bZIP转录因子基因的克隆及表达分析

采用电子克隆和RT-PCR方法,从条锈菌诱导的小麦品种水源11的cDNA中分离到一个编码bZIP转录因子基因的cDNA序列,暂被命名为TabZIP。TabZIP包含一个完整的1 071 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域;与水稻、玉米、拟南芥等植物bZIP蛋白的氨基酸序列相似性较高;TabZIP基因在小麦根中的表达量丰富,而在茎和叶中表达量很小;在小麦与条锈菌非亲和组合中,TabZIP基因高水平表达,而在亲和组合中没有明显的变化;防卫相关激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因的快速上调表达,表明TabZIP可能通过乙烯、茉莉酸信号途径介导小麦对条锈病的防御反应。     

12个主产区历史小麦品种抗叶锈病基因分析

近年来,小麦叶锈病发生有加重趋势,培育抗病品种是减轻小麦叶锈病危害的环保有效途径。用12个小麦品种及35个含已知抗叶锈病基因的载体品系在苗期接种19个不同毒性的叶锈菌生理小种,通过基因推导和系谱分析发掘待测品种中的抗叶锈病基因,并通过分子标记检测进一步验证;在田间接种强毒性混合生理小种,进行成株期病情严重度与普遍率调查,筛选慢锈性品种。结果表明,在石新828、百农3217、济南2号、泰山1号、石特14、晋麦2148、烟农15、小偃6号、温麦6号共9个品种中检测到Lr1、Lr26、Lr34、Lr37和Lr46共5个抗叶锈病基因,其中部分品种中发现多个抗性基因。成株期筛选出百农3217、平阳27、济南2号、泰山1号、石特14、晋麦2148、碧蚂4号、烟农15、小偃6号、温麦6号共10个慢叶锈性品种,其中碧蚂4号和小偃6号等品种是我国小麦育种的骨干亲本,探究这些品种中的抗病基因对培育小麦抗叶锈病品种具有重要意义。     

钙与叶锈菌侵染诱导小麦防卫反应的关系

采用活体注射法将不同浓度的钙信使阻断及激活药物注入小麦叶片,其中阻断药物注射后立即接种叶锈菌,研究了钙信使与小麦受叶锈菌侵染诱导的防卫反应的关系。结果表明,用Ca2 螯合剂EGTA除去或降低胞外Ca2 浓度,用Ca2 通道阻断剂Verapamil或La3 阻断胞外Ca2 进入胞质,都能部分地抑制叶锈菌诱导的防卫反应,即PAL,POD的活性升高和过敏性反应(HR)的发生。抑制程度随药物浓度升高而增高。注射Ca2 载体A23187能部分模拟叶锈菌侵染诱导的这3种防卫反应。说明叶锈菌侵染诱导的PAL,POD活性升高和HR的发生,需要胞外Ca2 进入胞内,Ca2 参与了叶锈菌侵染激活防卫反应的信号转导过程。     

小麦应答低磷的钙依赖蛋白激酶基因TaCPK1A和TaCPK10的克隆和表达

采用构建富集磷胁迫特异表达基因cDNA差减文库、序列分析和cDNA-AFLP技术,鉴定了2个应答低磷胁迫的钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因的表达序列标签。克隆、测序和比对结果表明,上述基因分别为TaCPK1A和TaCPK10。其cDNA长度分别为2 129 bp和1 696 bp,开放阅读框分别为1 599 bp和1 281 bp,分别编码532和426个氨基酸;具有CDPK的典型结构特征。系统进化分析表明,上述基因的核苷酸序列同源性低,分别来自不同的祖先。在对低磷胁迫的响应上,TaCPK1A在磷胁迫1~24 h范围内根系内的表达水平不断增强,叶内表达水平在1 h内明显被诱导,以后保持稳定;TaCPK10在相应磷胁迫时间范围根叶内的表达水平均呈低—高—低变化,在磷胁迫1 h的表达被诱导,以后又逐渐降至胁迫前水平。TaCPK1A和TaCPK10对氮、钾胁迫没有应答响应。结果表明,CDPK在介导小麦低磷胁迫的信号转导中具有重要作用,小麦中存在两种或多种CDPK介导的磷酸化过程参与低磷信号的转导。     

CIMMYT小麦材料的苗期和成株抗叶锈病鉴定

选择来自CIMMYT的103个小麦品种(系)及35个含有已知抗叶锈基因的对照品种,苗期接种17个中国小麦叶锈菌小种以鉴定这些品种中可能含有的抗叶锈病基因, 并于2008-2009和2009-2010连续2年对这些材料进行成株抗叶锈病鉴定。通过苗期鉴定结合系谱分析和分子检测,在46个品种中共鉴定出Lr26、Lr34、Lr42和Lr47等4个抗叶锈病基因,其中9个品种携带Lr26基因,28个品种含有成株抗叶锈病基因Lr34基因,Lr42可能存在于11个品种中,还有2个材料可能含有Lr47,其他57个品种(系)对供试的15个小种多数表现为高抗,没有鉴定出已知的抗叶锈病基因。通过两年的田间抗叶锈病鉴定共筛选出46个表现慢锈的品种。苗期和田间结果表明,CIMMYT材料中含有丰富的对我国叶锈菌小种有效的苗期和成株抗叶锈基因,这些材料均可应用于我国小麦的抗叶锈病育种。     

土耳其8个小麦品种农艺性状及抗叶锈性分析

为确定8个来自土耳其的普通小麦品种在我国的应用前景,对其进行全生育期农艺性状观察,并利用44个以Thatcher为背景的近等基因系(单基因系)作为已知基因的鉴别寄主,接种8个小麦叶锈菌致病型进行苗期抗叶锈基因推导,结合成株期抗病鉴定,初步明确了这些品种(系)的抗性和可能携带的抗病基因。利用20个与Lr基因紧密连锁或共分离的分子标记,对8个土耳其小麦品种进行抗叶锈病基因的进一步鉴定。推测YJ000900中可能含有Lr1、Lr3、Lr17、Lr20;YJ000906中可能含有Lr1、Lr17、Lr20;YJ000901、YJ000902、YJ000904、YJ000905、YJ000907中可能含有Lr1;8个材料中均不含Lr9、Lr19、Lr20、Lr21、Lr24、Lr26、Lr28、Lr29、Lr34、Lr35、Lr37、Lr38和Lr47基因。结果表明,来自土耳其的8个小麦材料具有较差的抗叶锈性、抗寒和抗倒伏能力,而且产量低,不适宜于大规模推广种植,也不能作为我国小麦抗叶锈的抗源使用。     

小麦抗白粉病SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式

为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制,构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交cDNA(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列后,得到94条EST,利用NCBI的BLAST在线序列比对工具对GenBank的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较,筛选出与病程相关蛋白基因同源的EST(Z25-1)和与谷胱甘肽硫转移酶同源的EST(Z440-1),GenBank登录号为EX567369和EX567360。以其EST序列为依据设计引物,通过RT-PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式,结果该2基因表达存在明显差异。其中,Z25-1在未接种白粉菌时具有一定的表达量,白粉菌侵染后表达量开始上升,侵染72 h时表达量最高,然后下降;Z440-1在未接种时也具有一定的表达量,但在接种初期表达微弱,甚至不表达,24 h后表达开始上升,到72 h时达最高,然后下降。本研究表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,且参与白粉病抗病反应,在白粉菌诱导72 h时表达量最高。     

Wheat mutants showing altered adult plant disease resistance

Wheat mutants, selected on an altered resistance phenotype to Puccinia striiformis f.sp. tritici, the causal agent of yellow rust, were assessed in greenhouse tests to determine the growth stage at which the mutant phenotype was expressed and which components of yellow rust resistance were altered. Four of the mutants showed reduced levels of yellow rust infection, while three exhibited increased levels of infection. The infection characters altered were those seen after the establishment of hyphal growth, i.e. days after inoculation to sporulation, the percentage of inoculated leaf tissue producing sporulating colonies and the number of spores produced per cm² of inoculated leaf tissue. The altered resistance phenotype was developmentally regulated in all of the mutants. The changes seen in the infection characters differed for each mutant, suggesting that different genes may have been altered. An altered resistance phenotype to brown rust and/or powdery mildew was also seen for some of the yellow rust mutants. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

小麦TaPP2-A13基因的表达响应逆境胁迫并与SCF复合体接头蛋白TaSKP1相互作用

To explore the function and molecular mechanism of Phloem protein 2 (PP2) gene in wheat (Triticum aestivum L.) response to stresses, a TaPP2-A13 putatively encoding a PP2 protein was obtained from TcLr15, a wheat near isogenic line against leaf rust pathogen, in the present study. The complete coding region of TaPP2-A13 encodes a hydrophilic polypeptide with molecular weight of 33.18 kD, and theoretical isoelectric point is 6.36. There is an F-box domain at N-terminal and a PP2 domain at C-terminal of the TaPP2-A13 protein sequence, which indicates that wheat TaPP2-A13 belongs to F-box/PP2 (FBP) subfamily. Wheat TaPP2-A13 shared relatively higher sequence similarity with PP2-A13 from Gramineae. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) results indicated that TaPP2-A13 was induced by infection of leaf rust pathogen (Puccinia triticina), and showed stronger expression in susceptible combination than that in resistant one. An obvious up-regulation of TaPP2-A13 was observed after treatment with abscisic acid (ABA), salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MeJA) in wheat. TaPP2-A13 was significantly down-regulated after treatment with PEG and H₂O₂, while TaPP2-A13 striking increased first, then fell down after NaCl treatment in wheat. Subcellular localization result indicated that TaPP2-A13 distributed in both of the nucleus and cytoplasm. The recombinant vector BD-TaPP2-A13 was used as the bait to screen Yeast 2 Hybrid (Y2H) library, 11 kinds of proteins were finally obtained. Further Y2H assays identified that TaPP2-A13 physically interacted with five kinds of proteins including TaPP2C5, TaSLY1, TaCHI, TaRbcS, and TaSKP1. BiFC and Co-IP results further confirmed that TaPP2-A13 interacted with TaSKP1, an adaptor protein from SKP1-Cullin-F-box (SCF) complex, which made us to speculate that TaPP2-A13 functions as a member of SCF complex by binding with TaSKP1. These findings laid some foundation for further analyzing the function of TaPP2-A13 and exploring its regulatory network.     

小麦TaPP2-A13基因的表达响应逆境胁迫并与SCF复合体接头蛋白TaSKP1相互作用

为探究韧皮部蛋白2(Phloem protein 2,PP2)基因在小麦(Triticum aestivum)响应逆境胁迫中的功能及作用机制,本文以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr15为材料获得一个小麦韧皮部蛋白2基因TaPP2-A13。该基因编码一个由298个氨基酸组成的亲水性蛋白质,相对分子量为33.18 kD,等电点为6.36。其N端为F-box结构域,C端具有典型的PP2结构域,属于F-box/PP2(FBP)亚家族成员。TaPP2-A13与禾本科植物中PP2-A13蛋白的亲缘关系较近。表达模式分析表明,TaPP2-A13的表达受叶锈菌(Puccinia triticina)侵染的诱导,且感病组合中表达更强。用脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和甲基茉莉酸(MeJA)处理后,TaPP2-A13总体呈现上调表达趋势。利用聚乙二醇(PEG)和H2O2处理后,小麦TaPP2-A13显著下调表达,而NaCl处理后TaPP2-A13呈现先上调后下调的表达趋势。亚细胞定位结果表明TaPP2-A13在细胞核和细胞质均有分布。以构建的重组载体BD-TaPP2-A13为诱饵筛选酵母文库,获得11种可能与TaPP2-A13互作的蛋白,酵母双杂交(Yeast 2 Hybrid,Y2H)确定其中的5种蛋白TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI、TaRbcS和TaSKP1分别与TaPP2-A13存在相互作用。进一步利用BiFC和Co-IP确认TaSKP1与TaPP2-A13两种蛋白质之间的相互作用关系,推测TaPP2-A13可能为SCF复合体成员。本研究结果为深入解析TaPP2-A13蛋白的功能,并探究其调控网络奠定了基础。