褐色橘蚜全蛋白双向电泳体系条件优化

为优化有效分离褐色橘蚜Toxoptera citricida全蛋白的双向电泳体系,比较了饱和酚抽提法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)/丙酮沉淀法、直接裂解液法和Tris-HCl法4种蛋白提取方法,以及蛋白上样量、聚焦条件和固相p H梯度(immobilized p H gradient,IPG)胶条对褐色橘蚜全蛋白双向电泳的影响。结果表明,TCA/丙酮沉淀法和直接裂解液法获得的全蛋白浓度分别为4.25、4.03μg/μL,显著高于饱和酚抽提法和Tris-HCl法,且TCA/丙酮沉淀法所提取的蛋白种类丰富度最高。采用TCA/丙酮沉淀法获得全蛋白,当上样量为100μg时,所得蛋白质点多、分辨率高、背景清晰,除盐3 h,等电聚焦量45 000 V·h,并选用p H 3~10非线性IPG胶条时,双向电泳图谱中横向拖尾现象少,蛋白点相对清晰,分布均匀。表明所建立的双向电泳体系,结合银染,可从褐色橘蚜全蛋白中识别出1 264个蛋白点,且重复性研究匹配率高,可用于褐色橘蚜蛋白质组学研究。     

蚜虫蛋白质组双向电泳体系条件优化

为优化有效分离蚜虫全蛋白的双向电泳体系,以豌豆蚜Acyrthosiphon pisum (Harris)为材料,比较了不同蛋白提取方法(裂解液提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、饱和酚抽提法)、蛋白上样量、IPG胶条pH梯度等条件对蚜虫全蛋白双向电泳的影响。结果表明:不同的蛋白提取方法所获得的豌豆蚜全蛋白提取率有显著差异,其中以饱和酚抽提法的提取率最高,为5.34±0.26 mg/g,且所提取的蛋白种类丰富度也优于其它2种方法;当蛋白上样量为100 μg时所得蛋白点为1 793±36个,高于其它上样量;相同条件下选用11 cm pH 3~10非线性IPG胶条时所得蛋白点为1 803±42个,优于pH 4~7的IPG胶条。表明采用饱和酚抽提法进行提取蛋白,选用11 cm pH 3~10非线性IPG胶条,以蛋白银染方法、分离胶浓度为12.5%进行双向电泳时最适蛋白上样量为100 μg,所得可识别蛋白质点最高,且重复性试验匹配率高,可用于豌豆蚜蛋白质组学研究。     

甘草愈伤组织蛋白质组双向电泳技术的建立

以来源于野生乌拉尔甘草的愈伤组织为试材,对甘草愈伤组织蛋白质的提取、SDS-PAGE电泳、上样量、染色方法等关键步骤进行了优化,结果表明:采用改良丙酮法可提高提取液中蛋白质的含量及单向电泳图谱的分辨率;17 cm IPG胶条上样量为450μg时,采用银染法提高了双向电泳图谱的分辨率及分离效果,获得了1 132个蛋白点。建立了一套适用于乌拉尔甘草的愈伤组织蛋白质组分析的双向电泳方法。     

香梨果萼黑斑病菌Alternaria alternata遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

 为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L^-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl₂介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。     

甜瓜种子携带的链格孢菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到14个链格孢菌分离物。通过菌落形态、产孢表型、分生孢子以及分生孢子梗等形态学观察,结合分析ITS-rDNA和histone 3基因序列,对链格孢菌分离物的种类进行鉴定;甜瓜种子携带的链格孢菌种类分别为细极链格孢(Alternaria tenuissima)、交链格孢(A. alternata)和倒果链格孢(A. obovoidea)。还研究了这些链格孢菌分离物对甜瓜离体叶片的致病性及其对种子发芽的影响;结果表明,除A. obovoidea外,另外两种链格孢菌均对甜瓜离体叶片具有致病性;A. tenuissima和A. alternata的孢子悬浮液对甜瓜种子发芽均有一定的抑制作用。这是国内首次围绕甜瓜种子传带链格孢菌的种类及其致病性开展详细的研究。     

基于刃天青微平板法测定交链格孢菌橘致病型对戊唑醇和苯醚甲环唑的敏感性

由交链格孢菌橘致病型(Alternaria alternata tangerine pathotype)引起的柑橘链格孢褐斑病(Alternaria brown spot,ABS)是柑橘上的主要病害,目前主要采用杀菌剂防治。本研究以采自中国各柑橘链格孢褐斑病发生区的54个交链格孢菌橘致病型菌株为供试群体,采用刃天青微平板法测定了病原菌孢子萌发和菌丝生长对戊唑醇和苯醚甲环唑的敏感性。结果表明:刃天青微平板法最佳体系中的培养基为完全培养基(CM),刃天青终浓度为40 μmol/L,孢子浓度为105个/mL。戊唑醇和苯醚甲环唑的有效抑制中浓度(EC50)范围分别为0.304~0.885 μg/mL和0.367~0.873 μg/mL,平均值分别为0.562和0.609 μg/mL。正态分布检测结果显示:这2种药剂抑制交链格孢菌橘致病型群体的EC50值均符合正态分布,因此认为所得EC50值可作为病原菌对戊唑醇和苯醚甲环唑的敏感性基线。本研究结果可为田间防治褐斑病和监测交链格孢菌对戊唑醇和苯醚甲环唑的抗药性奠定基础。     

甜瓜种子携带的链格孢菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到14个链格孢菌分离物。通过菌落形态、产孢表型、分生孢子以及分生孢子梗等形态学观察,结合分析ITS-rDNA和histone 3基因序列,对链格孢菌分离物的种类进行鉴定;甜瓜种子携带的链格孢菌种类分别为细极链格孢(Alternaria tenuissima)、交链格孢(A. alternata)和倒果链格孢(A. obovoidea)。还研究了这些链格孢菌分离物对甜瓜离体叶片的致病性及其对种子发芽的影响;结果表明,除A. obovoidea外,另外两种链格孢菌均对甜瓜离体叶片具有致病性;A. tenuissima和A. alternata的孢子悬浮液对甜瓜种子发芽均有一定的抑制作用。这是国内首次围绕甜瓜种子传带链格孢菌的种类及其致病性开展详细的研究。     

13种萜类化合物对胶孢炭疽菌和链格孢的抑制活性

炭疽菌Colletotrichum和链格孢Alternaria是引起植物病害的重要真菌,给农业生产造成巨大的损失。本研究选取13种萜类化合物,采用菌丝生长速率法对胶孢炭疽菌、链格孢进行抑菌活性分析。研究结果表明:香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对两种病原菌有较好的抑菌活性,其中香芹酚对胶孢炭疽菌和链格孢的抑菌活性最强,IC50分别为40.89μg/mL和18.19μg/mL。本试验为植物精油和天然杀菌剂的开发利用提供理论依据。     

尖镰孢胁迫下黄瓜茎部蛋白质差异表达分析

为揭示尖镰孢胁迫下黄瓜茎部蛋白质差异,以黄瓜枯萎病高抗品系‘D0327’和感病品系‘649’为试验材料,分别接种2个毒力不同的尖镰孢C9和S1菌株后提取黄瓜茎部蛋白,运用双向电泳技术研究了尖镰孢侵染后茎部蛋白质组的变化。结果表明,2个尖镰孢菌胁迫下,抗感材料茎部蛋白表达发生了变化。茎部蛋白质双向电泳图谱与对照图谱进行比较分析,成功鉴定出8个差异蛋白点。强毒力菌株C9胁迫下,感病品系中鉴定出3个差异蛋白,分别是烯醇化酶及亚基、肌动蛋白和放氧增强蛋白,抗病品系中差异蛋白为烯醇化酶及亚基、磷酸丙糖异构酶和核苷酸二磷酸激酶。弱毒力菌株S1胁迫下,感病品系中差异蛋白为Csf-2蛋白,抗病品系中差异蛋白为放氧增强蛋白。这些蛋白分别参与能量代谢、光合作用和胁迫反应。     

6种杀菌剂对4种常见植物病原菌的抑制作用

采用生长速率法,测定了多菌灵、克菌丹、多宁、戊唑醇、丙环唑、睛醇6种不同浓度的杀菌剂对链格孢菌(Alternaria sp)、苹果树腐烂病(Cytospora sp)、青霉菌(Penicillium)、黄曲霉(Aspergillus flavus)的抑制作用。通过回归曲线法,比较相关系数,并通过不同浓度梯度试验计算了6种药剂对4种病原菌的ED50和LD50的值,筛选出了杀菌率最优的杀菌剂。结果表明:55%多菌灵800倍、25%戊唑醇水乳剂500倍、25%睛醇乳油4000倍对苹果树腐烂病和链格孢菌的抑菌率达100%。而55%多菌灵200倍、50%克菌丹200倍、77%多宁200倍对青霉和黄曲霉抑菌率达90%以上。     

Identification of Alternaria spp. on wheat by pathogenicity assays and sequencing

The pathogenicity of Alternaria spp. isolated from wheat leaves collected in regions where alternaria leaf blight has been reported was compared with that of IMI reference isolates of A. triticina and A. alternata using two durum and two bread wheat genotypes. To identify isolates putatively corresponding to A. triticina , morphological and DNA sequence analyses based on ribosomal DNA from the internal transcribed spacer (ITS) region (ITS1, 5·8S rRNA gene, ITS2) and toxicity bioassays of culture filtrate were combined. Glasshouse inoculations provided reliable information to assess the pathogenicity of A. triticina isolates on wheat. Alternaria leaf blight symptoms were produced by the A. triticina isolates only on durum wheat cv. Bansi, while A. alternata , A. tenuissima and A. arborescens isolates were found to be nonpathogenic on the wheat cultivars tested. Alternaria triticina isolates were distinguished from other Alternaria species by Simmons and Roberts' sporulation pattern 6 and two to three conidia per sporulation unit associated with primary conidia bearing long (> 7  µ m) apical secondary conidiophores. Phylogenetic analysis also proved effective at discriminating wheat-pathogenic A. triticina from other nonpathogenic Alternaria species. Alternaria triticina isolates yielded longer ITS sequences than A. alternata , A. tenuissima and A. arborescens isolates, leading to clear-cut differences as visualized with agarose gel electrophoresis. Additionally, only culture filtrates of A. triticina isolates caused nonspecific necrotic lesions on leaves of 3-week-old wheat plants.     

雀麦花叶病毒德国株系与英国株系病毒粒子的比较研究

 采用多种方法对雀麦花叶病毒德国株系(BMV-G)及英国株系(BMV-E)粒子的提纯及RNAs的提取效果进行了比较,结果分别以聚乙二醇(PEG)沉淀法及两相酚提取法为佳。聚丙烯酰胺凝胶(PAA)电泳证明BMV-G具有5个RNA组份,比BMV-E (代表典型株系)多一个RNA-3a,其分子量为0.52×10⁶,介于RNA-3及RNA-4之间。另外变性及不变性RNAs分子量的测定结果也基本相同。薄层电泳分析指出BMV二种株系RNAs的碱基比也基本一致,同于Paul及Huth的报道。经34% CsCl平衡等密度离心得知BMV-G及BMV-E均具有4种粒子组份,其中最重的粒子的浮力比重值分别为1.3513及1.3534,而最轻的则分别达1.2993及1.3045。     

嘧霉胺对梨黑斑病菌(Alternaria alternata)的毒力及其药效评价

采用菌丝生长速率法测定了嘧霉胺对梨黑斑病病原菌链格孢菌(Alternaria alternata)的毒力,并进行其对梨黑斑病的田间药效试验。结果表明：嘧霉胺对梨黑斑病菌菌丝生长抑制的EC50为0.126 8 μg/mL ;40%嘧霉胺可湿性粉剂250～500 mg/L对梨黑斑病的防效为66%～82%,且该药剂在本试验剂量范围内对梨树安全。     

黄瓜对炭疽病诱导抗性的初步研究Ⅱ.诱导抗病机制的研究

 黄瓜植株经柑桔炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)诱导处理后,体内过氧化物酶、多酚氧化酚、苯丙氨酸解氨酶活性均比对照植株有显著增强。过氧化物酶同功酶聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳(PAGE)表明,经诱导处理后同功酶酶带增多,着色也加深。酚类物质和木质素含量在诱导处理后也明显提高。     

A Polymerase Chain Reaction-Based Method to Specifically Detect Alternaria alternata Apple Pathotype (A. mali), the Causal Agent of Alternaria Blotch of Apple

ABSTRACT Alternaria alternata apple pathotype (previously A. mali) causes Alternaria blotch on susceptible apple cultivars through the production of a host-specific toxin, AM-toxin. Identification of some Alternaria species, especially those that produce host-specific toxins, has been extremely difficult due to a high level of variability which extends even to nonpathogenic isolates. We have recently cloned and characterized a gene (AMT) that plays a crucial role in AM-toxin biosynthesis and demonstrated that it is only present in isolates of A. alternata apple pathotype. Using primers designed for the AMT gene, we developed a polymerase chainreaction-based method to specifically detect AM-toxin producing isolates of A. alternata apple pathotype.     

Alternaria alternata菌丝细胞壁凝集素的纯化与特性研究

 Alternaria alternata是接触性活体营养菌寄生真菌纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum的寄主真菌之一,该寄生过程中菌寄生真菌与寄主真菌的识别机制未见报道。本文分离、纯化了A.alternata菌丝细胞壁上的一种参与识别作用的特异性蛋白——凝集素,并对其特性以及在菌寄生过程中的作用做了初步研究,粗提液经硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析和SephacrylS 100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的凝集素AAL,经凝胶过滤层析法测得分子量为37.2kDa,经糖染色鉴定为一种糖蛋白。孢子凝集试验表明,AAL对O.tenellum的孢子具有极强的凝集力,在含量为3 325μg/mL时,30min内90%的O.tenellum孢子发生凝集作用,对照(不含AAL的缓冲液)凝集力则显著下降。上述结果说明AAL在A.alternata细胞壁蛋白抽提液和O.tenellum的孢子吸附中扮演着重要角色,可能起识别因子的作用。     

刺山柑(Capparis spinosa)总RNA不同提取方法的比较

以野生刺山柑叶片为材料,采用70%丙酮抽提研磨材料,结合TRIZOL,CTAB,SDS 3种常见的RNA提取方法提取总RNA,通过RNA获得率、纯度、电泳图谱以及RT-PCR反应等分析,初步确立了一种有效的提取刺山柑叶片总RNA的改良SDS法.该方法提取的RNA A<,260>/A<,280>值在1.88～1.94之间,电泳图谱完整,具有产量高、时间短、成本低等特点,所得的RNA可以用于RT-PCR和cDNA文库构建以及Northern杂交等后续实验.     

Alternaria brassicae produces a host-specific protein toxin from germinating spores on host leaves

Spore suspensions of Alternaria brassicae, the causal agent of gray leaf spot in Brassica plants, were incubated on the leaves of cabbage (B. oleracea) and spore germination fluid (SGF) was collected after 48 h. A high molecular weight (HMW) fraction (>10 kDa) was separated from the SGF by ultrafiltration. In a detached leaf assay, the HMW fraction induced visible symptoms only on host leaves and the toxicity was lost by treatment with proteinase K or heat at 60 degrees C for 15 min, indicating the presence of host-specific protein toxin(s). A protein toxin in the HMW fraction was purified by several chromatography steps. The toxin induced water-soaked symptoms followed by chlorosis at concentrations of 0.5 to 1 microg/ml on host leaves, but not on nonhost leaves even at 50 microg/ml. The toxin also had infection-inducing activity when added to spore suspension of a nonpathogenic isolate of A. alternata, causing symptoms similar to the infection of A. brassicae only on host leaves. These results indicate that a new host-specific protein toxin named ABR-toxin is released from germinating spores of A. brassicae on host leaves. ABR-toxin migrated as a protein of 27.5 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The isoelectric point of ABR-toxin was estimated to be approximately 7.0 and 21 N-terminal amino acid residues were sequenced.     

苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析

 蛋白质提取方法是双向电泳分析的关键。本研究中,我们通过优化提取条件,建立了适于苹果枝条表皮总蛋白提取的技术体系。在此基础上,开展了苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学研究,以期明确轮纹病菌胁迫下苹果枝条表皮细胞参与抗病反应的关键蛋白。具体方法是以未接菌及接菌后的苹果枝条表皮为材料,分别提取总蛋白,利用双向凝胶电泳技术结合质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)检测分析差异表达蛋白。经质谱检测及数据库检索,共有22个蛋白点得到成功鉴定,按照功能划分为光合作用相关、糖类及能量代谢相关、防御反应相关、蛋白质合成相关及未知功能蛋白等5类。其中参与防御反应的病程相关蛋白(APX、 β-1,3-葡聚糖酶、Mal d1、PR-1)可能是苹果枝条表皮细胞应答轮纹病菌胁迫过程中参与抗病反应的关键蛋白。     

GhMAPK参与调控棉花对链格孢的抗性

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联途径,由三种级次磷酸化的MAPKKK (MAPK kinase kinase)、MAPKK (MAPK kinase)和MAPK蛋白激酶组成,广泛参与植物防御反应的调控。本文利用已发布的陆地棉Gossypium hirsutum L.全基因组数据,对其中的MAPK家族基因编码序列进行多序列比对和聚类分析。结果显示,53个GhMAPK大都含有植物MAPK保守的TXY基序,并且能够聚集到AtMAPK的A、B、C、D四个族中。进而利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术,研究GhMAPK是否参与调控棉花对链格孢Alternaria alternata抗性。链格孢是引起棉花轮纹斑病并导致棉花早衰的主要病原真菌。结果发现,沉默GhMAPK3、GhMAPK7、GhMAPK9及GhMAPK19的棉花植株,抗病性显著下降,表明这4种GhMAPK正调控棉花对链格孢的抗性。进一步利用靶向性沉默策略,验证这4种GhMAPK中各同源基因对棉花链格孢抗性的调控作用。结果显示,仅同源基因GhMAPK3b、GhMAPK7b、GhMAPK7c、GhMAPK9a、GhMAPK9b、GhMAPK19b和GhMAPK19c参与正调控棉花对链格孢的抗性,而同源基因GhMAPK3a、GhMAPK7a、GhMAPK7d和GhMAPK19a并不调控棉花对链格孢的抗性。