芥子碱的提取纯化及HPLC法含量测定

目的:从白芥子中提取纯化芥子碱硫氰酸盐,并测定其含量,为中药外用制剂提供高纯度的天然透皮吸收促进剂。方法:白芥子脱脂,用不同浓度乙醇提取、浓缩物加20%硫氰酸钾溶液析晶,用蒸馏水反复重结晶。采用高效液相色谱法测定含量。色谱柱:Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相:2%醋酸-乙腈(15∶85),检测波长:326 nm,流速:1.0 m L/min,柱温:30℃。结果:用80%乙醇提取,蒸馏水和20%硫氰酸钾溶液比例为4∶1时,所得芥子碱呈浅黄色针状结晶,得率0.51%,含量95.70%。结论:采用本法提取纯化芥子碱,方法简单,纯度高,可为中药外用制剂选择天然透皮促进剂提供参考。     

梅花鹿瘤胃纤维素降解菌的分离鉴定及其酶活力测定

为获得来源于梅花鹿瘤胃的高效纤维素降解菌，本试验采集了3锯龄健康梅花鹿的新鲜瘤胃液，用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基分离筛选纤维素降解菌，综合其形态学、生理生化特征和16S rDNA基因测序等对分离菌株进行分类学鉴定，利用DNS法对菌株的产纤维素酶条件进行初步研究，并探讨以不同物质为底物时的纤维素酶酶学特性，为后期菌株的应用提供理论数据。结果显示，本试验从梅花鹿瘤胃液中分离的菌株N-11是一株高效纤维素降解菌，经鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。产酶性质研究结果表明，该菌株产纤维素酶活力在30~45℃（最适温度为40℃），pH为6.0~7.0（最适pH 6.0），碳源含量为2%~5%（最佳接种量5%）较高；培养36 h时达到产酶高峰，纤维素酶酶活力（CMCA）和滤纸酶酶活力（FPA）分别为12.563、12.414 U/mL，在20~50℃或pH 6.0~8.0环境下作用1 h，其相对酶活力均保持在80%以上，稳定性较好。以上结果表明，蜡样芽孢杆菌N-11具有较高的纤维素酶活力，在纤维素利用方面具有较高的应用价值。     

木质素降解菌的筛选及其漆酶性质研究

为筛选产漆酶的木质素降解菌,采用愈创木酚平板法和RB亮蓝平板法进行菌株筛选,利用16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定,通过液体发酵培养对漆酶活性和木质素降解能力进行研究。将漆酶基因cot A克隆到表达载体p ET-32a(+)上获得重组质粒p ET-32a(+)-Cot A并转化到BL21中进行表达,通过酶活测定将表达条件进行优化。结果:从白蚁肠道中成功筛选出1株产漆酶的木质素降解菌,鉴定为枯草芽胞杆菌。漆酶的最适酶活温度为60℃,最适酶活p H为3.5~4.0;0.2 mmol/L Cu2+可诱导菌株漆酶的产生,缩短了产酶时间并提高了酶活性。菌株木质素降解率在液体发酵培养24 h后达到了17.1%。漆酶基因大小为1 542 bp,表达的重组蛋白为85 ku,属于有活性的可溶性蛋白。在IPTG浓度为1mmol/L、Cu2+浓度为0.3mmol/L、诱导时间为9 h的条件下,漆酶蛋白活性可达到113.10 U/L。研究表明,本试验成功筛选出1株降解木质素能力较强的枯草芽胞杆菌,获得可分泌较高活性漆酶的重组菌,为木质素酶在畜牧业生产实践上的应用奠定了基础。     

山羊瘤胃中单宁降解菌的分离、筛选和鉴定

本试验旨在从山羊瘤胃中分离、筛选和鉴定单宁降解菌。从隆林山羊瘤胃采集内容物,采用单宁浓度耐受培养基进行初筛,再采用单宁酶活力鉴定培养基分离、筛选单宁降解菌,筛选出的细菌通过16S r DNA基因序列测定初步鉴定,将菌株在单宁浓度为0.5%、1%、1.5%的单宁酶诱导培养基中培养,测定酶活力。结果表明:共分离、筛选到4株降解单宁的细菌,根据16S r DNA基因序列分析结果,分别为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、克斯特菌(Kerstersia)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。经单宁酶诱导培养基培养后,Kerstersia的胞内单宁酶活力高于其他3株菌,而其他3株菌的酶活力较为接近;Kerstersia、Providencia vermicola和Pseudomonas aeruginosa经1%单宁浓度诱导的单宁酶活力均高于经0.5%和1.5%单宁浓度诱导(P0.05)。本试验成功从山羊瘤胃中筛选、分离、鉴定出4株单宁降解菌,且它们均表现出较高的单宁酶活力。     

灵芝漆酶在黑曲霉中的重组表达及发酵条件优化

【目的】 在黑曲霉（A.niger）中重组表达灵芝L菌漆酶基因，并对其发酵条件进行优化，旨在获得一株高产灵芝漆酶的黑曲霉基因工程菌。【方法】 从灵芝L菌克隆漆酶基因Lac-L，并根据黑曲霉密码子偏好性进行优化。选用黑曲霉糖化酶启动子（PglaA）、信号肽及终止子为表达原件，以米曲霉pyrG基因为筛选标记，构建漆酶表达盒，采用聚乙二醇-CaCl₂法将其转化至黑曲霉X1（ΔpyrG）原生质体中。对转化子进行PCR验证及固态发酵酶活测定，筛选高产漆酶重组菌株，并对阳性转化子固态发酵培养基碳源、无机与有机氮源比例、Cu²⁺浓度及发酵时间进行优化。【结果】 经尿嘧啶缺陷及含2，2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS）培养基筛选获得25株重组漆酶转化子，酶活复筛获得灵芝漆酶异源表达6号重组菌株，发酵72 h酶活可达3 532.6 U/kg，宿主菌株的酶活仅为58.37 U/kg。重组6号菌优化后的最适固态发酵条件为：以麸皮为基础培养基，添加2%麦芽糖、2%（NH₄）₂SO₄、0.25 g/L CuSO₄，发酵60 h时重组菌株产漆酶活力最高，达到6 255.47 U/kg。【结论】 在黑曲霉中成功实现灵芝L菌漆酶基因Lac-L的异源表达。     

竹鼠肠道中厌氧纤维素降解菌的分离与鉴定

本试验旨在从竹鼠肠道中分离厌氧纤维素降解菌并鉴定。取中华竹鼠盲肠内容物稀释,采用含2种不同纤维素[微晶纤维素(MCC)和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)]的培养基在厌氧条件下对纤维素降解菌进行初筛,后又经以纤维二糖为唯一碳源的培养基的多次复筛,选出的菌株进行经形态学和分子生物学的鉴定。结果表明:经过初筛和复筛,筛选出了2株厌氧纤维素降解菌。初筛培养基采用MCC和CMC-Na最终筛选出的2株纤维素降解菌的纤维素酶活力分别为6.599和5.268U/m L。菌株经PCR鉴定、测序,用所得序列构建系统发育树,得出这2株菌与酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)具有很高的同源性,达99%,二者均属于梭菌属(Clostridium)。本试验从竹鼠盲肠中成功筛选出2株纤维素降解菌,经鉴定确定属于梭菌属。     

断奶马驹小肠菌群多样性分析

本试验旨在研究断奶马驹十二指肠、空肠和回肠菌群的多样性，为全面评价断奶后马属动物小肠发育、健康、功能等提供参考依据。选取6匹平均体重为（147.08±4.86） kg的哈萨克断奶马驹为研究对象，在相同的饲养管理和饲粮营养水平条件下饲养60 d。采集断奶马驹十二指肠、空肠和回肠的内容物，采用16S rRNA高通量测序技术检测各肠段内容物中菌群的多样性。结果显示：1）断奶马驹十二指肠菌群的ACE指数和PD＿whole＿tree指数均显著高于空肠（P<0.05）。2）在门水平上，厚壁菌门是十二指肠、空肠和回肠中最主要的优势菌，其次是变形菌门和拟杆菌门，其中空肠中厚壁菌门的相对丰度比回肠提高了26.98%(P<0.05)，回肠菌群中变形菌门和梭杆菌门的相对丰度显著或极显著高于十二指肠和空肠（P<0.05或P<0.01）。在科水平上，回肠中肠杆菌科和巴斯德氏菌科的相对丰度均显著高于空肠（P<0.05），且巴斯德氏菌科的相对丰度还显著高于十二指肠（P<0.05）；十二指肠中瘤胃球菌科的相对丰度较空肠提高了156.04%(P<0.05)。在属水平上，回肠中肠...     

青藏高原低温纤维素降解菌的筛选与酶学特性

以青藏高原冷地早熟禾草地土壤为样品,筛选低温纤维素降解菌株。采用刚果红染色法(水解圈法)和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法进行菌株筛选与酶学特性研究,结合形态学与分子生物学方法对其进行鉴定。筛选出一株低温纤维素降解菌株(LD19),经鉴定为钉斑链霉菌(Streptomyces clavifer),同时该菌还具有降解半纤维素的能力。该菌产纤维素酶的最适温度为40℃,最适pH值为6,在30～70℃、pH值4～10时相对酶活力较稳定,Zn~(2+)对酶有抑制作用。该菌产半纤维素酶的最适温度为50℃,最适pH值为6,在30～40℃、pH值4～9时相对酶活力较稳定,Cu~(2+)等对该酶有促进作用。该菌株在培养102 h后两种酶的相对酶活力均达到最高值。菌株LD19可以同时分泌低温纤维素酶和半纤维素酶,在饲用酶制剂的应用中具有较大潜力。     

厌氧培养箱法对新疆驴盲肠中纤维素分解菌的初步分离与鉴定

为探寻新疆驴盲肠中的优势纤维素分解菌,笔者以可培养法对驴盲肠中茵群进行富集培养、分离纯化、刚果红识别（初筛）、形态学观察、滤纸酶活力测定、复筛以及生化鉴定得到1株酶活性较高的菌株;根据与《伯杰细菌系统鉴定手册》和《细菌编码鉴定表》比对,确定该茵株是编码为AG632的埃希大肠杆茵。     

一株纤维素降解菌的筛选、鉴定及对饲料粗纤维降解效果的研究

通过筛选高活性纤维素酶产生菌,为微生物纤维素酶制剂的开发提供理论依据。采用刚果红染色法从绵羊粪便中分离筛选纤维素降解菌,用DNS法测定酶活力,根据酶活力复筛后,分离得到一株能够产生高活力纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的目的菌B5。通过形态学观察和16S rDNA序列测定,对B5菌株进行种属鉴定;应用B5菌株对四种纤维性饲料进行消化降解实验,探究菌株B5降解饲料粗纤维的特性。形态学观察确定B5菌落符合放线菌的特征;分子学鉴定其16S rDNA序列全长1 585 bp,在进化关系上与链霉菌属(Streptomyces sp.)聚成一簇,同源性高达99%。鉴定B5菌株属于链霉菌属成员。B5菌株对饲料粗纤维降解效率与酶活力显著相关,对饲料粗纤维降解效率与饲料中纤维素含量相关性不明显。     

羊粪中纤维素降解菌的筛选、鉴定及评价

为发掘优良纤维素降解菌株，筛选羊粪堆肥发酵菌剂菌种资源，本研究以滤纸条为唯一碳源，从新鲜羊粪中分离出26株具有纤维素降解能力的菌株。通过测定其纤维素酶活力与秸秆降解率，筛选出7株优良纤维素降解菌株，并对7株菌进行16S rDNA序列比对，确定其分类学地位。利用线性拟合和多元回归解析菌株产酶活力与秸秆降解率之间的关系。结果表明，7株菌的全酶活性为1.03～2.83 U·mL^-1、外切酶为3.42～5.78 U·mL^-1、内切酶为1.24～3.25 U·mL^-1和β-葡萄糖苷酶为1.09～2.259 U·mL^-1。经鉴定分别为山原申氏菌(Shinella yambaruensis)、鸡眼草申氏菌(Shinella kummerowiae)、土地鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis terrae subsp)、植物内生成对杆菌(Dyadobacter endophyticus)、潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)、水原假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas suwonensis)等...     

猪肠道产多肽类抗生素活性菌株的筛选与鉴定

为了筛选产多肽类抗菌物质的活性菌株,为生产猪用益生素及新型抗菌活性物质提供菌源,试验分别从猪的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠中分离肠道内生菌2 317株,利用临床分离的致病性大肠杆菌作为指示菌,通过点种法进行对峙培养,分析其抑菌活性。结果表明:复筛所得50株肠道内生菌株均对指示菌具有明显抑菌活性,筛选得率为2.2%。经过胰蛋白酶、蛋白酶K水解处理,将发酵上清液抑菌活性明显降低或丧失的结肠57号和盲肠2号菌确定为可产蛋白或多肽类抗生素的活性菌株。经16S rDNA的序列检测及比对,两菌株均属于枯草芽孢杆菌。     

东祁连山高寒草地土壤产漆酶真菌的筛选、鉴定及产酶条件的初步研究

以高寒草地土壤分离出的56个真菌菌株为研究对象,经愈创木酚-PDA培养基和α-萘酚-PDA选择性培养基初步筛选, 再根据菌株在愈创木酚、邻苯二酚、邻苯甲苯胺为底物的选择性培养基上菌体生长及菌落大小、漆酶催化氧化还原反应产生的变色圈直径大小及其变色圈颜色深浅程度,以及测定油菜秸秆诱导的液体发酵产漆酶活力,筛选出1株产漆酶酶活真菌菌株(编号为310b)。经rDNA-ITS基因序列分析,初步鉴定为Marasmius tricolor。对菌株310b产漆酶的条件进行了初步研究,结果表明,菌株310b在25℃培养条件下产漆酶活力最大,初始pH值为4.0时,漆酶活力最大,蔗糖、蛋白胨分别为诱导菌株产漆酶活力最高的碳、氮源。几种非营养有机物对菌株产漆酶活力大小不同,α-萘酚和吐温-80对菌株产漆酶没有明显影响,愈创木酚、单宁酸、吲哚乙酸抑制菌株产漆酶,其中吲哚乙酸抑制作用最强烈(P＜0.01)。在Cu²⁺浓度为0.001~0.025 g/L范围内,随Cu²⁺增加,产漆酶活力增加,0.025 g/L时产酶活力最大。随着接种量的增加,诱导漆酶活力增加。在60~180 r/min的转速范围内,随着转速的增加,漆酶活力增加。油菜秸秆粉的量在0~1 g范围内,随着秸秆添加量的增加,漆酶活力增加;1~2 g范围内,随着秸秆添加量的增加,漆酶活力减小。     

蒙古马盲肠中纤维素分解菌的筛选、鉴定及酶学特性分析

为研究蒙古马耐粗饲料的优良特点,试验以蒙古马盲肠内容物为研究对象,旨在筛选、分离出高效的蒙古马源纤维素分解菌株,并对分离菌株进行鉴定和酶学特性分析。采用羧甲基纤维素平板法和摇瓶发酵法分离菌株并鉴定菌株类型。最后,通过测定纤维素酶活力分析菌株在不同pH、温度、碳源和氮源条件下的酶学特性。研究从蒙古马盲肠内容物中分离筛选到具有较高降解纤维素能力的解淀粉芽孢杆菌H3(Bacillus amyloliquefaciens H3)。菌株H3分泌纤维素酶的最适p H为4.8,在p H 3.0～8.0范围内,其酶活力相对稳定;在温度为65℃,酶活力最高,当温度为40～50℃时,该酶活力维持在80%左右,稳定性强。此外,H3发酵所需的最佳碳源为玉米粉,最佳氮源为2%的蛋白胨+酵母粉复合物(1:1),它具有相对较高的纤维素酶活力,有深入开发的潜力。     

产纤维素酶真菌的筛选与鉴定

为从秸秆中分离出能够降解纤维的菌株,试验采取秸秆样品接种马铃薯琼脂培养基,在室温环境下培养,取分离菌接种纤维素刚果红琼脂培养基,筛选能形成较大降解圈的细菌,并进行形态学和分子生物学鉴定,测定其纤维素酶性质。结果表明,经分子生物学鉴定,筛选菌为黑曲霉菌,该菌在室温环境能够生长,菌株降解圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)为7.64。筛选菌在20 ℃环境下培养5 d酶活达到最高值,为42.18 U/mL。纤维素酶最适pH为7.0,最适反应温度为20 ℃,在20~40 ℃或pH 6.0~8.0环境下作用1 h,相对酶活力仍保持在90%以上。综上所述,本试验分离的黑曲霉菌株是低温产纤维素酶菌株,产酶能力较强,具有潜在的开发价值。     

自腐真菌的筛选以及对其秸秆降解能力的研究

通过选择性培养基、PDA—RB平板显色和PDA-Bavendamm平板显色反应从土壤样品中反复筛选获得5株产木质素降解酶能力较强的菌株,经鉴定为白腐菌属。小麦秸秆降解试验显示,菌株P3对秸秆中木质素的降解率最高,培养15d后达到11．47％,其次为菌株P5,降解率为8．12％,为进一步的研究奠定了基础。     

黄芪发酵菌的筛选鉴定及纤维素酶学性质试验

为分离发酵黄芪菌株,试验采取黄芪样品接种营养琼脂,置30℃环境培养。取分离菌接种纤维素刚果红琼脂,筛选能形成较大降解圈的细菌进行鉴定,并测定其纤维素酶性质。结果表明,筛选菌为解淀粉芽孢杆菌,该菌株降解圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)为4.03。在37℃环境培养36 h酶活力达到高峰,为32.16 U/m L。在低于60℃及pH值6.0~8.0环境纤维素酶较稳定,可保持酶活力90%以上。     

高产纤维素酶真菌的筛选鉴定与紫外诱变选育研究

试验旨在拟从腐朽木材和腐质土壤中获得1种高效的纤维素酶生产菌，利用紫外线诱变技术对其进行改造。采用刚果红染色法和酶活性试验，筛选出2株纤维素酶产率较高的菌（菌株HS5、菌株1）。经形态学和分子鉴定，菌株HS5为黄曲霉（Aspergillus flavus），菌株1为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。在固体产酶培养基中，以水稻秸秆为唯一的碳源，28℃培养4 d后，HS5滤纸酶（FPA）的酶活为306 U/g，羟甲基化纤维素（CMC）的酶活为592.2 U/g；菌株1的FPA酶活为214.2 U/g,CMC酶活为523.8 U/g，表现出了较好的降解纤维素的能力。紫外诱变处理得到产酶能力提高的突变菌株为UR-07和URM-13。与原始菌株相比，UR-07的FPA和CMC酶活分别比原始菌株HS5提高了15.86%、16.68%,URM-13的FPA和CMC酶活比菌株分别提高了26.94%、19.03%。研究表明，经紫外诱变后，产纤维素酶真菌的产酶能力有所提升且具有较好的遗传稳定性，两株菌株在纤维素酶的生产和纤维素类物质降解菌剂的研究中具有较高的潜力。     

白腐真菌的筛选以及对其秸秆降解能力的研究

通过选择性培养基、PDA—RB平板显色和PDA—Bavendamm平板显色反应从土壤样品中反复筛选获得5株产木质素降解酶能力较强的菌株,经鉴定为白腐菌属。小麦秸秆降解试验显示,菌株P3对秸秆中木质素的降解率最高,培养15d后达到11.47%,其次为菌株P5,降解率为8.12%,为进一步的研究奠定了基础。     

高效氨氮降解克雷伯菌筛选鉴定和适宜条件研究

为了获得高效氨氮降解克雷伯菌属菌株，试验采用16S rDNA基因序列鉴定方法筛选克雷伯菌属菌株，利用标准纳氏试剂分光光度法检测培养基内的氨氮含量，并计算氨氮降解率，确定高效氨氮降解菌株；结合形态学和系统进化树构建结果对菌株进行分类鉴定；通过对培养时间、温度和pH值的筛选，研究适宜培养条件；通过与其他高效氨氮降解克雷伯菌gt-1、gt-2、gt-3、ps-1、ps-2、sw-1、sw-2、sd-1、sd-2、sd-3进行比较，验证分离菌株的氨氮降解能力，通过动物试验和污水降解试验研究分离菌株的安全性和在污水内的氨氮降解能力，并检测了菌株的存活能力。结果表明：试验成功筛选出1株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)M169-3,具有高效氨氮降解能力。在初始氨氮含量为250 mg/L的氨氮基础培养基A内，M169-3的最高氨氮降解率为58.41%,最适温度为35℃,最适pH值为7,适应性强；在初始氨氮含量为120 mg/L的氨氮基础培养基B内，M169-3的氨氮降解率为96.64%,与其他高效克雷伯菌比较差异不显著(P>0.05);在氨氮含量为387.35 mg/L...