白腐真菌产木质素降解酶的条件及酶学性质的研究

本研究以酶活力为评价指标,通过产酶条件的优化,选择出白腐真菌的最适培养条件,并对其部分酶作用特性进行了研究。试验结果表明:白腐真菌产锰过氧化物酶的最适培养条件是:最佳碳源是麸皮,葡萄糖(碳源)对酶活力影响不大;最佳氮源是牛肉膏;最佳培养时间是96 h。该菌产漆酶的最适培养条件是:最佳碳源是麸皮;最佳氮源是牛肉膏;最佳培养时间是96 h。锰过氧化物酶的最适pH范围是4.4～4.8,最适底物浓度是1.2 mmol/L,最适反应温度是35～40℃;漆酶的最适pH为4.8,最适底物浓度是1.2 mmol/L,最适反应温度是40℃。金属离子Cu2+,Co2+对锰过氧化物酶和漆酶有激活作用,Fe2+对两种酶活力有一定的抑制作用,而Ag+则完全抑制漆酶的活性,Mg2+对两种酶活力影响不大。     

白腐菌Trametes pubescens MB89产漆酶发酵条件的优化及其部分酶学性质的研究

以白腐菌T.pubescens MB89为漆酶培养菌.研究培养方式、温度和Cu2+等因素对发酵产生漆酶的影响.在漆酶性质研究中,研究了温度、pH值、底物种类、金属离子等因素对漆酶催化活性的影响.结果表明,T.pubescens MB89产漆酶的最佳培养温度为25℃,最适Cu2+浓度1.0μmol/L,120 r/min振荡培养优于静止培养.T.pubescens MB89漆酶氧化底物的最适作用温度为25℃,最适pH随底物的不同而不同.Cu2+、Co2+、K+、Ag+对漆酶活性有促进作用,Fe2+、Fe2+、ca2+等离子对漆酶活性有抑制作用.Na+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等离子对漆酶酶活性影响不大.由此说明,振荡培养T pubescens MB89生产漆酶的过程中Cu2+的存在可以加速漆酶的产生.T pubescens MB89漆酶酶活性受温度、pH值、金属离子、底物等因素的影响.     

2株白腐真菌产漆酶条件的优化

采用液体摇瓶培养方法,探讨了碳源、氮源、pH值、培养温度等各种因素对白腐真菌分泌漆酶能力的影响,采用单因素和正交试验对主要的影响因素进行了优化。研究得出菌株的最佳产漆酶培养基为:200 g/L马铃薯+20 g/L葡萄糖+5 g/L酵母膏+1.5 g/L MgSO4+0.1 g/L维生素B1+0.05 g/L ZnSO4+0.05 g/L MnSO4+3.0 g/LKH2PO4。优化后的培养基最适发酵条件为:起始pH值6,转速130 r/min,装液量70 mL,在32℃条件下摇床培养发酵10 d左右时,粗酶液的酶活力达到12.7 U/g。     

白腐菌（T.pubescens MB89）漆酶的固定化及其酶学性质研究

【目的】研究白腐菌T.pubescens MB89漆酶固定化处理的最佳条件及其酶学性质。【方法】采用壳聚糖、壳聚糖铜、海藻酸钠/壳聚糖和TEOS/PEG 4种载体对漆酶进行固定,测定固定化漆酶酶活性在不同温度、pH值和固定化条件处理下的变化。【结果】白腐菌漆酶的固定化方法和最佳固定条件为:①壳聚糖固定化漆酶(IE1)。戊二醛最佳浓度为0.4 mol/L,最适交联时间8 h,最佳给酶量1.5 mg/g;②壳聚糖铜固定化漆酶(IE2)。CuSO4.5 H2O最佳添加量为0.6 mg/g,最适络合时间10 h,最佳给酶量0.25 mg/g;③海藻酸钠/壳聚糖固定化漆酶(IE3)。0.2mol/L海藻酸钠,0.2 mol/L CaCl2,0.1 mol/L戊二醛,0.15 mol/L壳聚糖,最佳给酶量1.5 mg/g;④TEOS/PEG固定化漆酶(IE4)。最适PEG分子质量为600~800,最适添加量1.5 g/g,最佳给酶量1.5 mg/g。4种固定化漆酶的酶学性质:IE1和IE4的最适温度均为60℃,IE2和IE3为30℃;IE1、IE3和IE4的最适pH值为4.5,IE2为4.0;与游离漆酶(Lac)的最适pH值相比,固定化漆酶的最适pH值均向碱性方向偏移,且固定化漆酶的酸碱稳定性、热稳定性和贮存稳定性均优于游离漆酶。【结论】固定化酶的最适合温度、pH均受固定化载体和方法的影响,固定化漆酶的稳定性均优于游离漆酶。     

无柄灵芝菌LZ02高产漆酶条件及部分酶学性质分析

【目的】 从采自新疆天山的无柄灵芝菌(G.resinaceum)中筛选获得1株高产漆酶的LZ02菌株,对其产酶条件进行优化,研究部分酶学性质。【方法】 采用单因素实验,对其产酶条件优化并研究其酶学特性,采用双向电泳检测酶蛋白。【结果】 LZ02菌株产漆酶的最佳碳源为2.5%麦麸+1%葡萄糖,最佳氮源为干酪素; Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、 Zn²⁺和Ca²⁺的添加对LZ02产漆酶有一定的促进作用,而Co²⁺具有明显的抑制作用;藜芦醇和愈创木酚抑制产酶并使产酶高峰由第3 d推后至第9 d,添加没食子酸和ABTS对产酶影响不大,单宁酸对产酶有抑制作用。LZ02菌漆酶最适反应温度为60℃,且在80℃仍具有漆酶活性;在40℃,pH 4.0~5.0,酶活性最稳定;最适反应pH为3.0,Mn²⁺ 、Zn²⁺、 Cu²⁺ 、Ba²⁺和K⁺对酶稳定性有一定的促进作用,Co²⁺、Cd²⁺、Cr²⁺和Pb²⁺对酶的稳定性具有明显的破坏作用;对菌体及发酵液进行了双向电泳检测,测定其等电点为4.1;获得了1个纯化酶蛋白质谱序列,该蛋白与Ganoderma Lucidum来源的Laccase高度同源。【结论】 无柄灵芝菌(G.resinaceum)漆酶的合成和分泌受到营养水平、培养条件、生长阶段以及培养基中诱导剂的严格调控,木质素或木质素相关的芳香类化合物、N源和C源也能调节漆酶的合成;漆酶活性对不同种类、不同浓度的金属离子以及诱导剂的响应不尽相同,其具有较复杂的生理功能及调控机制。     

杏鲍菇漆酶的诱导及其对染料的脱色降解

为了研究培养条件对杏鲍菇诱导漆酶的影响,进一步开发杏鲍菇漆酶在环境治理中的应用,采用碳源、氮源、不同浓度的Cu2+、香兰素、愈创木酚等诱导物对杏鲍菇产漆酶进行诱导并运用紫外分光光度法探索了反应温度、p H值、染料浓度和杏鲍菇漆酶用量对3种染料(酸性铬兰K、溴酚蓝、龙胆紫)的降解效果。结果表明:碳源为麦芽糖,氮源为蛋白胨时杏鲍菇产漆酶活力最高,在一定的浓度范围内,不同诱导物能促进漆酶的合成,当Cu2+0.2 mmol/L、愈创木酚0.01 mmol/L、香兰素0.1~0.5 mmol/L时对杏鲍菇漆酶的诱导效果最显著。杏鲍菇漆酶对染料具有较好的脱色效果,在p H值5.0、40℃条件下反应16 h,酸性铬兰K、溴酚蓝、龙胆紫的脱色率分别达到76.9%、69.1%、63.8%,显示杏鲍菇漆酶在处理染料废水方面具有良好的应用前景。     

滑菇PholiotanamekoSW-01菌株产漆酶营养条件及部分酶学性质研究

[目的]探索滑菇PholiotarmmekoSW-01菌株产漆酶的最佳营养条件及其酶学性质。[方法]首先选取不同的碳源、氮源、pH、金属离子进行单因素试验,得到最佳培养基成分,进行四因素三水平的响应面分析。在酶学性质试验中,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性。[结果]最适的碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨,最适pH为5,Cu2＋能显著提高漆酶的产量。响应面分析结果表明,最佳的产漆酶条件为葡萄糖42．50g／L,蛋白胨2．10g／L,pH5．47,cu2＋浓度1．67mmol／L,在此条件下漆酶活性为943．27U。在酶学性质试验中,漆酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为4．8。[结论]条件优化能显著提高滑菇漆酶产量。稳定性试验表明,漆酶对温度较敏感,对pH反应不敏感,在弱酸环境中能发挥较高的活性。     

白腐菌(Trametes pubescens MB89)漆酶的培养与纯化

【目的】通过培养白腐菌Trametes pubescens提取胞外漆酶。【方法】以白腐菌T.pubescensMB89为漆酶培养菌,在25℃120 r/min条件下用基础GP液体培养基(300 mL培养基中含40 g/L丙三醇、15 g/L蛋白胨和1 g/LMgSO4.7 H2O)进行胞外漆酶的震荡培养,培养10 d后,添加CuSO4.5 H2O使培养基中Cu2+的最终浓度达1 mmol/L。定时测定漆酶活力,于漆酶活力开始下降时终止培养。将菌体破碎、离心后,用DEAE-Ssepharose对获得的漆酶进行分离和纯化。【结果】在以葡萄糖为碳源的培养基中添加一定浓度的Cu2+,可促进菌体的生长和漆酶活力的增加。培养前10 d,漆酶活力增加缓慢,培养10 d后添加CuSO4.5 H2O,漆酶活力快速增加,并于培养的第19天达到最大,为51.70 U/mL。用超滤方法分离纯化漆酶,可使漆酶纯度达53%。【结论】T.pubescensMB89可作为生产漆酶的菌种,在漆酶培养过程中,Cu2+对漆酶活力的增加有促进作用。     

基因工程菌漆酶降解2-氯苯酚的研究

利用基因工程菌甲醇毕赤酵母(PMAD16/pMET(A-Lcc1)培养产生的重组漆酶,研究了重组漆酶对降解2-氯苯酚的影响。结果表明:重组漆酶对2-氯苯酚降解的最佳pH值为6.0,温度为50℃,当溶液中漆酶活力为1.2 U/mL时,在最适脱色条件下作用6 h,粗漆酶和纯化漆酶对2-氯苯酚(250 mg/L)的降解率分别为91.3%和88.2%,重组漆酶可有效地降解2-氯苯酚。     

糙皮侧耳P5漆酶酶学性质的初步研究

对糙皮侧耳P5漆酶的酶学性质进行了研究.结果表明,该酶的最适反应温度为63℃,最适反应pH为6.0;该酶的酸碱稳定性和温度稳定性较好,在pH5.0～6.5条件下处理24h可保留97％以上的酶活,4～20℃处理1h酶活保持不变,60℃处理1h可保留80％以上的酶活;金属离子对漆酶酶活有明显的影响,Cu2+、Mn2+、Zn2+对酶的活性有促进作用,Ca2+、Fe2+、Fe3+和Pb2+对酶的活性有抑制作用.该结果可为耐高温漆酶的开发利用提供参考.     

大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design（CCD）响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著（P=0.0001）,可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu²⁺>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L^-1,KH₂PO₄ 1 g?L^-1,尿素1.46 g?L^-1,MgSO₄ 0.5 g?L^-1,蛋白胨2 g?L^-1,玉米浆0.5 g?L^-1,CuSO₄ 0.07 g?L^-1,Tween80 3 mL?L^-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL^-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L^-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L^-1?min^-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。     

耐铜菌株4bs的鉴定及其对染料脱色的效果

从土壤中筛选出1株具有较高漆酶活性的菌株,经分子生物学方法鉴定,该菌株为芽孢杆菌属细菌,将其命名为Bacillus sp.4bs。菌株4bs的最适生长温度和pH分别为37℃和7.0,其在6%(w/v)Na Cl溶液中能够正常生长,在含有2.0 mmol/L Cu~(2+)的培养基中仍生长旺盛。以丁香醛连氮为底物,菌株4bs的芽孢漆酶活性为35.66U/g(干重),其芽孢漆酶最适反应温度为80℃,最适反应pH值为6.8;0.1 mmol/L的半胱氨酸、二硫苏糖醇和叠氮化钠抑制其活性,10 mmol/L的Na~+, K~+, Cu~(2+)和Li~+能够增强其活性。在pH 6.8的体系中,菌株4bs芽孢漆酶对结晶紫和茜素红在6 h内的脱色率分别为83.57%和77.16%;加入乙酰丁香酮(Ace)作介体时,对靛红的脱色率由52.73%提高到94.98%,对活性黑5的脱色率由19.01%提高到90.10%。     

木质层孔菌产木聚糖酶和β-葡聚糖酶的研究

研究了木质层孔菌不同发酵条件对木聚糖酶、β-葡聚糖酶性能的影响,并对其酶作用特性进行了研究结果表明:木质层孔菌产木聚糖酶最适碳源为麸皮,氮源为蛋白胨,最适发酵温度为25℃;而产β-葡聚糖酶最适碳源为木糖,氮源为酵母膏,最适发酵温度为28℃。就产酶时间而言,在发酵前60 h菌株均不产生β-葡聚糖酶和木聚糖酶,在72 h才有微量的酶产生,到192～240 h两种酶均达到产酶高峰,并以216h产酶最高;两种酶的最佳缓冲液均为柠檬酸缓冲液,木聚糖酶的最适作用pH值5.0,最适反应温度为50℃,而β-葡聚糖酶最适作用pH值4.6,最适反应温度为60℃。     

黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶发酵条件优化

[目的]优化黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[方法]采用单因素试验和正交试验相结合的方法优化了黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[结果]单因素试验结果表明,以蔗糖为碳源的黑曲霉生长最好,所产酶的活力最高,最佳碳源浓度为15g/L;蛋白胨浓度为15g/L时黑曲霉干重最大,蛋白胨浓度为10g／L时所产酶的活力最高;pH值为5时黑曲霉的生物量最大,pH值为4时所产酶的活力最高;培养温度为30℃时,所产酶的活力最高。最佳培养基组成为葡萄糖20g／L＋蛋白胨5g/L＋MgSO4 0．05g/L＋KC10．5g/L＋K,HPO4 1g/L＋FeSO4 0．5g/L。当pH值为5,发酵温度为25℃,孢子接种量为10^6cfu/ml,发酵时间为96h时,培养基上黑曲霉产α-半乳糖苷酶的活力最高,达到（3．250±0．035）U／ml。[结论]该试验为仪一半乳糖苷酶的工业化生产提供了参考依据。     

一株产壳聚糖酶菌株的培养条件优化

[目的]优化产壳聚糖酶菌株的培养条件。[方法]对一株从海洋中筛选的假单胞菌XK-3菌株产壳聚糖酶条件进行优化。[结果]培养基最佳组成:葡萄糖30.0 g/L,牛肉膏为15.0 g/L,(NH_4)_2SO_415.0 g/L,K_2HPO_42.0 g/L,KH_2PO_42.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L。摇瓶培养最佳条件:培养初始pH 6.0,培养温度28℃,装液量20%。Mg~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)对壳聚糖酶活力有一定的促进作用,Fe~(3+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)对壳聚糖酶活力有一定的抑制作用。摇瓶培养条件优化后得到的壳聚糖酶活力为3 430 U/L,优化前壳聚糖酶活力为1 072 U/L,优化后是优化前的3.2倍。摇瓶培养得到菌体的最适生长时间为24 h,发酵于64 h后结束。[结论]优化后的培养条件提高了壳聚糖酶产量,使该菌株的工业应用成为可能。     

香樟(Cinnamomum camphora)果实酪氨酸酶的分离纯化及特性分析

[目的]检测并分离香樟果实中的酪氨酸酶。[方法]从香樟成熟果实中分离和纯化出酪氨酸酶,研究该酶的酶活、蛋白质含量、最适pH值、最适温度、动力学特性和稳定性,并分析了不同金属离子、化合物和中药对其酶活的影响。[结果]经分离和纯化,获得43 kD的酪氨酸酶。该酶的最适pH值和最适温度分别为7.5和50℃。以L-DOPA为底物,测得Km和Vmax分别为12.83 mmol/L和180.65U/mg。该酶在pH值4~7和较高温度时均较为稳定。Al3+和Cu2+对该酶活性具有抑制作用,而Zn2+、Mg2+等则有激活作用。250mmol/LEDTA对该酶有激活作用,抗坏血酸和1 mmol/Lβ-巯基乙醇有完全抑制作用。中药女贞对其有强激活作用,乌梅对其抑制作用最明显。[结论]香樟果实中酪氨酸酶同工酶的存在为该酶的纯化带来一定难度。     

青霉QM-1产酸性β-甘露聚糖酶液体发酵条件研究

[目的]为酸性β-甘露聚糖酶生产菌株的开发与应用提供技术参考。[方法]以单因子试验和正交试验对青霉QM-1（Penicillium sp．）液体发酵产酸性β-甘露聚糖酶条件进行研究。[结果]产酶最适培养基配方：麸皮＋魔芋粉（2：1）10．0g／L,NaNO3 2．0s／L,KH2PO4 1．5g/L,MgSO4·7H2O 0．3g／L,H2O 1000ml。最适培养条件为：起始pH值6．0,装液量为50ml／250ml三角瓶,转速为175r／min,在35℃下培养4d,最高酶活力达86．3IU。该菌所产粗酶液最适反应温度为60℃。[结论]麸皮和硝态氯能有效促进青霉QM—1产酸性β-甘露聚糖酶,且所产的β-甘露聚糖酶有一定的温度耐受性。