过量表达甘菊CBF1基因提高拟南芥抗旱耐盐能力

CBF是一类植物特异性、具有多种功能的转录因子。本研究将从甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)中分离的ClCBF1基因构建到植物表达载体pBI121上,并采用农杆菌介导的花序浸染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,共获得4个转基因株系经过抗性筛选和RT-PCR验证,对其中表达量较高的3个转基因株系进行研究,结果表明:在150mmol·L~(-1)甘露醇培养基中转基因拟南芥的种子萌发率和根长平均为野生型的2.0倍和1.2倍,在150mmol·L~(-1) NaCl培养基中转基因拟南芥种子萌发率和根长平均为野生型的1.1倍和1.4倍;在干旱和盐胁迫条件下,转基因拟南芥幼苗的成活率高于野生型,并且超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型(P0.05),丙二醛(MDA)含量及相对电导率显著低于野生型植株(P0.05)。说明ClCBF1基因在拟南芥受到干旱和盐胁迫过程中发挥一定作用。     

日本百脉根LjbHLH34基因克隆及耐旱功能鉴定

干旱是影响植物生长发育的重要环境因素。本研究分析了日本百脉根抗旱相关基因LjbHLH34的耐旱功能，初步解析其响应干旱胁迫的分子机制，以期为百脉根抗旱分子育种提供理论基础。本研究克隆得到的LjbHLH34基因大小为711 bp、编码236个氨基酸，属bHLH转录因子家族成员。系统进化树分析显示，LjbHLH34蛋白与拟南芥bHLHⅣ亚家族中AtbHLH34和AtbHLH104亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明LjbHLH34在日本百脉根的根中表达量最高，叶中次之，茎中最少，暗示其在日本百脉根多个组织中发挥作用；同时LjbHLH34基因也受聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)诱导表达。在酵母中检测发现LjbHLH34具有转录激活活性；亚细胞定位试验表明LjbHLH34蛋白定位于细胞核中。将LjbHLH34基因转入拟南芥获得过表达株系。在200 mmol·L^-1甘露醇胁迫下，LjbHLH34转基因拟南芥的根长明显长于野生型。干旱处理后，野生型拟南芥比转基因拟南芥萎蔫程度更加明显，而转基因株系的相对含水量和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于野生型，丙二醛(MDA)积累...     

珍稀泌盐植物长叶红砂RtSOD基因的克隆及功能分析

长叶红砂是一种强旱生泌盐盐生植物,对盐渍荒漠环境具有极强的适应性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。本研究利用已有长叶红砂转录组数据库中SOD基因的已知序列设计引物,采用PCR方法克隆得到大小为663 bp、编码220个氨基酸的SOD基因的开放阅读框,并将其定名为RtSOD。预测该基因编码蛋白分子量为55.90 kDa,理论等电点5.11。多重序列比对分析结果显示该蛋白属于Cu/Zn SOD家族,与其他植物中SOD蛋白同源性较高。系统进化分析结果显示RtSOD基因与刚毛柽柳的SOD基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示NaCl、4 ℃、PEG、H₂O₂及ABA处理均能诱导该基因表达。构建RtSOD真核表达载体,将其转化到拟南芥中,结果发现:盐、干旱胁迫条件下,转RtSOD基因拟南芥的生长状况明显优于野生型,转基因株系抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)和脯氨酸含量较野生型显著升高,H₂O₂及MDA含量较野生型显著降低。qRT-PCR检测发现转基因拟南芥中响应逆境胁迫相关基因的表达量均显著高于野生型。上述结果说明RtSOD基因的过表达可提高转基因植物的抗逆性,进一步说明RtSOD参与长叶红砂对非生物胁迫的响应,是该植物抗氧化系统中的重要元件。     

过量表达紫花苜蓿MsHB7基因对拟南芥耐旱性的影响

同源异型域-亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）第I类亚家族在植物非生物胁迫调控过程中起着重要作用,已在多个物种中进行了克隆鉴定,但关于紫花苜蓿该家族基因的研究还鲜有报道。本研究旨在研究紫花苜蓿HD-Zip第I类亚家族基因MsHB7对拟南芥抗旱性的调控功能。通过克隆得到大小为738 bp、编码245个氨基酸的MsHB7基因的开放阅读框。多重序列比对和系统进化树分析结果显示,MsHB7蛋白属于HD-Zip I亚家族,且与拟南芥中ATHB7和ATHB12亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,MsHB7基因受干旱诱导。将MsHB7基因转化拟南芥并获得了阳性植株。干旱处理后,转基因拟南芥比野生型拟南芥萎蔫程度更明显,转基因植株相对含水量显著低于野生型拟南芥,并积累了更多的脯氨酸和丙二醛。qRT-PCR检测发现处理之后逆境胁迫指示基因ATCAT1、 ATDREB2A和ATRD29A在转基因拟南芥中的表达量显著升高,而ATLEA3的表达量显著下降。上述结果表明MsHB7基因的过表达可降低转基因拟南芥的耐旱性,为进一步开发利用该基因提供理论依据。     

柱花草9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(SgNCED1)的克隆及表达分析

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是高等植物ABA生物合成途径中的关键酶,本研究以3种豆科植物NCED的同源序列设计简并引物,用RT-PCR结合RACE以及嵌套PCR的方法,从柱花草叶片中克隆了一个编码NCED的基因,命名为SgNCED1。其cDNA全长2241 bp,开放阅读框架为1809 bp,编码602个氨基酸。Southern杂交结果表明,该基因在柱花草基因组中以单拷贝形式存在。氨基酸序列同源比对和系统进化分析表明SgNCED1与花生的AhNCED1高度同源(92%),与另外3种豆科植物的NCED也有很高的同源性(72%~75%)。亚细胞定位预测表明SgNCED1蛋白的N-末端具有叶绿体转运肽。叶片脱水诱导的SgNCED1基因的表达与内源ABA的积累、变化同步。     

白羊草BiMYB52基因的克隆及转基因拟南芥抗旱性表达分析

白羊草(Bothriochloa ischaemum)是一种耐旱的优良乡土草种。为了探索白羊草转录因子MYB的结构和功能,本研究以白羊草转录组测序中筛选出的一段对干旱胁迫响应表达量变化显著的MYB序列为基础,采用基于拓扑异构酶快速克隆法从白羊草中克隆了一个R2R3-MYB基因BiMYB52,该基因编码237个氨基酸。为了深入研究BiMYB52基因的抗旱性,利用染色体步移技术扩增出了BiMYB52启动子序列,构建了pCAMBIA1301-BiMYB52过表达载体,采用农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,然后对野生拟南芥和转基因拟南芥进行干旱胁迫处理。结果表明,干旱胁迫复水后,转基因拟南芥的存活率显著高于野生拟南芥,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量是干旱胁迫后转基因拟南芥的显著低于对照,脯氨酸(Proline, Pro)含量则显著高于对照。由此推测BiMYB52基因可能增加了拟南芥对干旱胁迫的抵抗能力。这为白羊草抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

桑树中拟南芥同源基因mNHX1的克隆及其功能研究

通过RT-PCR法从桑芽的全RNA中逆转录合成了桑芽cDNA库,以此为模板,用PCR技术克隆了拟南芥的同源基因mNHX1,该基因是编码植物细胞液泡膜上Na+/H+逆向运转蛋白的基因。用农杆菌法将mNHX1导入拟南芥,获得了过量表达转基因植株,并进行了功能研究。从51个转基因抗性植株中共筛选到18个纯系。结果表明,转mNHX1基因的拟南芥种子在含有100~200 mmol/L NaC l的MS培养基上,种子的发芽率明显高于野生型。同时,在含有150、250 mmol/L浓度NaC l的基质中,转基因植株的抗盐性能明显高于野生型。根据已报道的At-NHX1同源基因的功能推断,mNHX1所编码的细胞液泡膜上Na+/H+逆向运转蛋白是桑树抗盐性能的一个极其重要的因素。     

唐古特白刺类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(NtUFGT)的克隆与功能分析

花青素是植物体内重要的黄酮类次生代谢产物,其强大的抗氧化能力对植物抵抗由各种非生物胁迫带来的氧化损伤发挥着重要的作用。本研究基于转录组数据,从唐古特白刺cDNA中克隆得到一个类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因,将其命名为NtUFGT。该基因开放阅读框长度为1407 bp,编码468个氨基酸,预测该基因编码的蛋白质相对分子质量为51.37 kDa。多重序列比对分析结果显示,其编码蛋白属于UDP-glycosyltransferases蛋白家族。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在唐古特白刺中的表达模式,发现该基因的表达具有组织特异性,由高到低依次为花>果实>茎>叶>根;同时该基因能被聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)等非生物胁迫强烈诱导表达。构建该基因的真核表达载体pPZP221:35S:NtUFGT,使用花序浸染法转化拟南芥并筛选至T₃代,RT-PCR验证表明,NtUFGT基因在转基因拟南芥3个株系中均明显表达。测定干旱胁迫条件下野生型(WT)和转基因拟南芥(OE株系)生长状况和抗逆相关生理生化指标,结果发现转基因拟南芥生长状况明显优于野生型,根长更长,鲜重和叶绿素含量更高,同时OE株系积累了更多的花青素和总黄酮。与表型一致,相较于WT,OE株系具有更高的抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶(SOD);过氧化物酶(POD);过氧化氢酶(CAT)],积累了更多的还原性谷胱甘肽(GSH)和脯氨酸,同时其丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)含量显著低于WT;基因定量分析结果显示,OE株系拟南芥中抗逆相关基因AtCAT1、AtPOD1、AtRD29A及脯氨酸合成基因AtP5CS的表达量明显高于WT。以上结果说明,NtUFGT能有效提高转基因拟南芥中花青素和总黄酮含量,赋予植物更强的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而增强了植物对干旱胁迫的耐受性。     

紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表达分析及遗传转化

胚胎晚期富集蛋白(LEA)广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。本研究利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆了一个LEA4类基因的开放阅读框(ORF),命名为MsLEA4-4。该基因编码512个氨基酸,结构分析显示MsLEA4-4包含5个重复的由11个氨基酸TAQAAKEKTQQ组成的序列特征。利用实时荧光定量PCR检测了MsLEA4-4在不同逆境下的表达量,结果显示,该基因受干旱、NaCl、Cu²⁺、Zn²⁺和外源ABA诱导表达上调,其中NaCl胁迫2 h、Cu²⁺和Zn²⁺胁迫8 h,MsLEA4-4基因表达量最高;冷胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量随处理时间的延长呈逐渐上升趋势,表明该基因可能参与了紫花苜蓿的抗逆性调控。构建植物超表达载体pCAMBIA3301-MsLEA4-4,采用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,通过草铵膦(PPT)筛选和分子检测,7株抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入拟南芥基因组中。本研究为进一步探索MsLEA4-4基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

白三叶TrSAMDC1克隆及表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)在植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。通过分子生物学技术克隆得到一个全长为1559 bp的白三叶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因,并命名为TrSAMDC1。对该序列进行生物信息学分析表明:TrSAMDC1开放阅读框长度为1077 bp,编码358个氨基酸;预测其编码的蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,二级结构的主要构件为无规则卷曲,三级结构为同源二聚体,可能定位于细胞质中;系统进化树表明TrSAMDC1与其他豆科植物SAMDC亲缘关系很近,在进化上高度保守。分析该基因在重金属镉(CdSO₄)、低温(4 ℃)、高温(35 ℃)、干旱(PEG-6000)和盐(NaCl)等非生物胁迫以及100 μmol·L^-1脱落酸(ABA)和1 mmol·L^-1生长素(IAA)等激素处理下的表达模式发现TrSAMDC1的表达具有组织器官和时空特异性:所有处理都能显著上调叶片的相对表达量,并且在大多数处理12 h后达到峰值。而根系表达量虽较对照有差异,但对各种处理的敏感程度显著低于叶片。推测该基因能在调节植物的生长发育以及植物应对非生物胁迫尤其是高温和重金属镉胁迫中发挥重要作用,以上结果为进一步研究该基因奠定了基础。     

桑树钙调素蛋白基因MCaM-3的克隆及序列分析与诱导表达

钙调素蛋白(calmodulin CaM)作为真核生物细胞内的多功能Ca2+结合蛋白,在调节植物的生长发育、环境适应性和抗逆性方面具有重要作用。利用桑树表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆了一个编码桑树CaM基因的全长cDNA序列,命名为MCaM-3(GenBank登录号:GQ303247)。序列分析表明,MCaM-3全长951bp,存在143 bp的5′端非翻译序列(5′-UTR)和358 bp的3′端非翻译序列(3′-UTR),其开放读码框(ORF)长450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.85 kD,等电点为3.95。用在线软件SMART分析显示,MCaM-3蛋白含有4个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+。同源分析表明,CaM基因在桑树与拟南芥、杨树、大豆、小麦、水稻、玉米各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种CaM基因的系统进化分析表明,桑树与蓖麻、烟草、大黄、樱桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,与正常生长环境相比,MCaM-3基因mRNA的转录水平在低温、干旱、盐胁迫条件下均显著提高,初步推测MCaM-3基因与桑树的抗逆性有一定关联。     

碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

从碱茅酵母cDNA文库中经过NaCl、NaHCO₃筛选,均得到长为1153 bp碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因(PutTPS)片段。通过3'End cDNA amplification方法获得基因缺失的3'序列,该基因全长3358 bp,编码882个氨基酸。氨基酸序列比较结果表明,PutTPS氨基酸序列与水稻、拟南芥、玉米等多种高等植物的TPS蛋白的同源性高达60%90%。利用Northern blot技术,研究该基因的组织表达模式及NaCl、NaHCO₃胁迫处理下基因的表达模式变化;同时对转pYES₂- PutTPS基因酵母菌株进行盐、碱、氧化胁迫、渗透胁迫处理,观察其在逆境下的生存表现。结果表明,PutTPS具有组织表达特异性,其中在根和花中表达量最大;NaCl、NaHCO₃会诱导PutTPS 基因在根和叶中的上调表达;同时重组酵母菌株对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力显著增强。以上研究结果表明,碱茅PutTPS基因与逆境之间具有一定的应答关系,并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

结缕草ZjCSD基因的克隆及表达分析

铜锌超氧化物歧化酶是植物响应逆境胁迫过程中的关键酶,其含量和活性与植物抗逆性密切相关。本研究以结缕草cDNA为模板,利用同源克隆法,从结缕草转录组数据库中克隆获得了结缕草ZjCSD基因,该基因编码一个含有152个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示:ZjCSD基因编码蛋白为稳定的、亲水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,定位于细胞质中,含有CSD蛋白家族特有的保守结构域,具有典型的Cu²⁺和Zn²⁺结合位点;与小米、玉米等禾本科植物具有较高的同源性,进化关系较近。采用实时荧光定量PCR研究该基因在不同组织中、不同胁迫处理下的表达模式,结果表明,ZjCSD基因在根、茎、叶中都有表达,叶中表达量最高;干旱胁迫(30% PEG)、盐胁迫(150 mmol/L NaCl)和Cd²⁺胁迫(200 mg/L Cd²⁺)均能诱导ZjCSD基因表达量上调,Pb²⁺胁迫(1 g/L Pb²⁺)诱导ZjCSD基因表达量下调。故推测结缕草ZjCSD基因在结缕草应对干旱、盐和重金属胁迫的过程中发挥作用。     

西伯利亚白刺肌动蛋白基因的分离与特性分析

利用兼并PCR及RACE技术克隆了西伯利亚白刺的肌动蛋白基因(Nitraria sibirica Actin, NsAct),并对其基因结构和表达特性进行了分析。所克隆的NsAct cDNA全长序列为1 831 bp,包含1 134 bp的开放阅读框,编码377个氨基酸;基因组DNA全长序列为2 913 bp,包含5个外显子和4个内含子。系统进化分析结果显示,NsAct与其他植物的肌动蛋白基因具有较高的同源性,与芒果(无患子目)亲缘关系最为接近。基因表达特性分析的结果显示,该基因在根、茎、叶中的表达量基本一致;在干旱、盐、低温及外源脱落酸胁迫下,表达量无明显变化,这些结果验证了该基因作为分子内标的可靠性。     

结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草逆境胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草(Zoysia japonica)盐胁迫条件下的转录组数据为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR法,克隆了924 bp长的结缕草ZjCCS基因的CDS序列。同源性分析显示该基因与谷子(Setaria italica)同源性最高,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究该基因在非生物胁迫条件下在结缕草叶片中的表达情况,结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈先上升后下降的趋势,4 h表达量最高,相对于盐胁迫,干旱和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因可能在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。     

野生大豆盐胁迫响应基因GsPIP的克隆及其序列分析

盐胁迫是影响植物生长、发育以至产量的重要因素,野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料,是天然的优质抗性基因库。本研究以耐盐东北野生大豆为试材,利用东北农业大学植物生物工程研究室已获得的基因芯片杂交结果,对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫EST数据库中各EST在胁迫下的表达情况进行了分析,从中选出了1个在高盐、低温、干旱胁迫早期均上调表达的3′-EST,序列分析表明该EST编码质膜结合蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP),属于主嵌入蛋白(major intrinsic protein, MIP)家族;通过电子克隆和改进的5′-RACE获得了基因完整的编码区;其翻译产物与含羞草质膜结合蛋白的相似性为90%,将该基因命名为GsPIP。GsPIP基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的跨膜结构域,无信号肽,与已发现的植物PIP蛋白一致。本研究获得的基因具有自主知识产权,通过进一步的功能分析,可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源,并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据。     

干旱预处理对一年生黑麦草耐盐性的影响

全球土壤盐渍化正在威胁着植物的生长发育,提高植物抗盐性已是当前亟待解决的问题。利用植物对逆境胁迫的交叉适应性是提高抗逆性的一种经济有效的方法,但关于干旱能否增强植物耐盐性的研究甚少。本试验以一年生黑麦草（Lolium multiflorum Lam.）为试验材料,对植物进行单一盐处理（NaCl）、经干旱预处理的盐处理（PEG-NaCl）,以及盐旱同时处理（PEG+NaCl）,比较相对含水量、叶绿素含量、丙二醛、钠离子及钾离子含量等生理指标。结果表明：盐胁迫使植物的钠离子含量显著增加,叶绿素含量及相对含水量降低;但经PEG处理后,相比于单一盐处理,叶绿素及钠离子分别有所增加及降低,其中,5% PEG的作用显著优于10% PEG处理;而盐旱同时发生则对植物造成了最大的伤害。因此,适宜强度的干旱预处理在一定程度上可减少盐胁迫对植物的伤害。     

西藏野生垂穗披碱草EnCBL10基因的克隆与功能研究

钙调磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-Like Proteins，CBLs）是钙信号通路中重要成员，在植物应答多种非生物胁迫中具有重要的作用。本研究基于前期转录组数据，在西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）中筛选EnCBL10基因，将其异源表达于烟草（Nicotiana tabacum）中，分析转基因植株EnCBL10在低温和干旱胁迫下的生长及生理响应。结果表明：EnCBL10开放阅读框为792 bp，编码263个氨基酸。EnCBL10蛋白的理论等电点为5.17，为疏水蛋白和非分泌蛋白。低温和干旱胁迫下，对比于野生型烟草，转基因烟草叶片的细胞膜稳定性显著增加，过氧化物酶（Peroxidase，POD），抗坏血酸过氧化物酶（Aseorbateperoxidase，APX）和谷胱甘肽还原酶（Gluathione reductase，GR）活性显著升高。低温胁迫下，两个转基因株系的脯氨酸含量分别提高了79.7%和70.8%（P<0.05）；在干旱胁迫下，野生型植株（WT）和过表达植株中脯氨酸含量均有所降低，但转基因植株比WT的下降幅度小。因此，EnCBL10基因可能在垂穗披碱草的耐寒和耐旱调控中发挥重要功能。