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用叶片检测转基因水稻对潮霉素反应的可靠性研究 总被引:5,自引:1,他引:5
水稻的转基因研究一般以潮霉素磷酸转移酶(HyglomychlPhosphtobamfemse,6P6)基因HPT作为选择标记,因此潮霉素抗性检测的可靠性至关重要.该项研究以中花11和日本晴的T1,T2和T6代转基因水稻为材料,研究了苗期、减数分裂的完全伸展叶和乳熟期不同部位的叶片对潮霉素的抗性反应,同步提取相应叶片的DNA进行HPT基因的PCR扩增,两者符合率达到97.04%.结果表明,利用叶片对潮霉素的反应检测转基因水稻的方法适用于不同世代、不同生育期和不同部位的叶片,具有很高的可行性和可靠性. 相似文献
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利用农杆菌混合液介导的共转化法,研究不同浓度的农杆菌混合液浸染5种水稻品种的愈伤组织,进而获得共转化再生植株。对转基因植株进行叶片潮霉素抗性检测和螟虫田间抗性鉴定的结果表明,农杆菌混合液浓度OD600为0.6左右时,其浸染能力较强;5个品种中以浙粳27的再生效率最高。转基因植株叶片经潮霉素抗性检测,潮霉素阳性率为78.13%,经PCR检测转基因植株Cry1A(b)基因阳性率为15.11%。自然抗性鉴定结果表明:Cry1A(b)基因阳性的转基因植株对稻纵卷叶螟具有很好的抗性。基因分离的鉴定结果表明:HPT基因与Cry1A(b)基因在共转化转基因植株的后代中发生了分离。 相似文献
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无抗性选择标记转AP1基因抗病水稻新品系的选育 总被引:6,自引:0,他引:6
为获得无任何抗生素抗性基因的抗病转基因水稻新品系,将克隆自甜椒的两亲性蛋白AP1基因与潮霉素抗性选择标记基因(HPT)分别构建位于同一农杆菌双元载体上的两个独立的T-DNA区中,并经农杆菌介导,将其导入江苏省推广的两个粳稻品种广陵香粳和武香粳9号中,获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明,AP1基因和HPT基因已同时导入受体基因组中,并从共转化植株的自交后代中筛选到了无HPT基因的转AP1基因水稻植株。结合田间农艺性状考察,选育了多个无抗性选择标记基因的纯合转AP1基因水稻新品系;抗病性鉴定结果表明,转AP1基因水稻对稻白叶枯病的抗性与未转化对照相比有显著提高,部分转基因水稻对纹枯病的抗性与未转化对照相比也有一定程度的提高。 相似文献
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潮霉素和PPT对水稻愈伤组织筛选效果的比较 总被引:10,自引:0,他引:10
分别以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt基因)和除草剂抗性基因(bar基因)作为筛选标记基因的载体和农杆菌组合转化水稻光温敏核不育系粳稻品种农垦58S和籼稻品种培矮64S,以两个筛选标记基因的相应筛选剂潮霉素(Hyg)和PPT(Basta)对水稻愈伤组织进行筛选研究,初步确定了不同筛选剂对不同水稻愈伤组织的筛选浓度,并比较了两个筛选标记基因的筛选效果.结果表明,不同水稻品种对筛选剂的浓度要求不一样,粳稻品种以Hyg 50mg/L,PPT30mg/L较为适合;籼稻品种以Hyg 50mg/L,PPT 10mg/L,较为适合.PPT(Basta)对粳稻品种农垦58S筛选有效,而对籼稻品种培矮64S来说则易产生假阳性.Hyg作为水稻愈伤组织的筛选剂比PPT(Basta)好. 相似文献
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研究带潮霉素磷酸转移酶基因的转基因水稻及常规水稻穗期施用潮霉素B溶液后的反应.结果发现,常规水稻在穗苞期注射50,75, 100 mg·L-1潮霉素B溶液后,注射穗抽穗后分别出现26.3%,27.9%,32.7%的枯死穗粒,且分别有5%,15%,20%的穗苞枯死株,抽穗期喷施50,75,100 mg·L-1潮霉素B溶液后,穗部毒性症状表现为颖壳黄褐色,黄褐色颖壳穗粒分别为9.70%,14.6%,16.2%;而带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因稻均未出现上述毒性症状. 相似文献
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Breeding of Selectable Marker-Free Transgenic Rice Lines Containing AP1 Gene with Enhanced Disease Resistance 总被引:1,自引:0,他引:1
YU Heng-xiu LIU Qiao-quan WANG Ling ZHAO Zhi-peng XU Li HUANG Ben-li GONG Zhi-yun TANG Shu-zhu GU Ming-hong 《中国农业科学(英文版)》2006,5(11):805-811
In order to obtain marker-free transgenic rice with improved disease resistance, the AP1 gene of Capsicum annuum and hygromycin-resistance gene (HPT) were cloned into the two separate T-DNA regions of the binary vector pSB130, respectively, and introduced into the calli derived from the immature seeds of two elite japonica rice varieties, Guangling Xiangjing and Wuxiangjing 9, mediated by Agrobacterium-mediated transformation. Many cotransgenic rice lines containing both the AP1 gene and the marker gene were regenerated and the integration of both transgenes in the transgenic rice plants was confirmed by either PCR or Southern blotting technique. Several selectable marker-free transgenic rice plants were subsequently obtained from the progeny of the cotransformants, and confirmed by both PCR and Southern blotting analysis. These transgenic rice lines were tested in the field and their resistance to disease was carefully investigated, the results showed that after inoculation the resistance to either bacterial blight or sheath blight of the selected transgenic lines was improved when compared with those of wild type. 相似文献
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水稻P450基因Oscyp71Z2增强稻瘟病抗性的机制 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】分析水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在稻瘟病抗性中的作用,并解析其介导的水稻抗稻瘟病机制。【方法】根据高抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12表达谱结果,筛选到一个表达量高达114.6倍的细胞色素P450基因Oscyp71Z2(NCBI登录号:Os07g0217600)。根据Oscyp71Z2全长编码区序列设计引物,以水稻模式粳稻品种日本晴的cDNA为模板,通过PCR扩增Oscyp71Z2全长编码区序列。将所得的cDNA序列经测序后,与双元表达载体pVec8连接,构建超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2。采用冻融法将构建的超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2质粒转入农杆菌菌株EHA105,并利用农杆菌转化法获得Oscyp71Z2超表达水稻。常规PCR技术检测T4代Oscyp71Z2超量表达水稻中选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因(hygromycin phosphotransferase gene,hph),并通过qRT-PCR检测超量表达水稻中目的基因Oscyp71Z2的表达量。进一步对阳性超量表达水稻(T4、T5和T6)进行稻瘟病表型鉴定,并检测植保素含量变化(T4)。【结果】RT-PCR和qRT-PCR结果显示,水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在高抗稻瘟病的转hrf1水稻中有较高的表达,与表达谱数据一致。通过生物信息学分析Oscyp71Z2全长1 554 bp,含有2个细胞色素P450保守结构域,是CYP71Z2亚家族成员。将Oscyp71Z2成功连接到双元载体pVec8,利用农杆菌介导法获得Oscyp71Z2超量表达水稻。超量表达水稻株系在各生育期、株高等性状,与非转基因水稻日本晴基本一致。超量表达株系中Oscyp71Z2的表达量较野生型有显著升高。超量表达水稻的穗颈瘟抗性等级维持在1-2级,表现为抗病或者中抗,而野生型水稻的穗颈瘟等级为3-4级,表现为感病,Oscyp71Z2在水稻中超量表达显著增强了对穗颈瘟的抗性。Oscyp71Z2超量表达株系每克新鲜叶片中植保素MA和PB含量平均是328和124 ng,相对于野生型的85和42 ng•g-1新鲜叶片有显著升高。Oscyp71Z2超量表达株系中涉及到植保素MA和PB合成通路的4个关键基因的表达量较野生型有显著地升高。【结论】水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2通过调控植保素生物合成通路,赋予水稻稻瘟病抗性。 相似文献
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以密阳46(MY46)为轮回亲本,采取连续回交,结合GUS标记基因辅助选择技术,育成了Bt基因近等基因系抗螟虫密阳46(RIMY46).经考察,RIMY46及其所配杂种Ⅱ32A/RIMY46的GUS反应和PCR检测均为阳性,且高抗螟虫.在早期营养生长阶段,RIMY46苗高比MY46低,分蘖数比MY46少,表明纯合态Bt基因对纯系植株的前期生长进程有一定延缓作用,这种影响随着植株长大而减小,最终除导致抽穗延迟和整精米率降低外,对其余8个农艺性状和9个稻米品质性状的影响则均不显著.比较Bt近等基因系所配杂种Ⅱ32A/RIMY46和Ⅱ32A/MY46有关性状的表现差异,结果则发现杂合态Bt基因对杂种F1性状表达均无明显的负作用. 相似文献
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本研究采用农杆菌介导的遗传转化技术,将CmTreⅡ(膜结合型海藻糖酶基因一个靶位点)导入粳稻中花11号中,利用CmTreⅡ-dsRNA(含有膜结合型海藻糖酶基因一个靶位点的双链RNA)的沉默效应,沉默稻纵卷叶螟的膜结合型海藻糖酶,最终获得一批抗虫性较好的转基因纯合株系。研究中进一步检测了这些株系的室外卷叶率、白叶率以及室内抗虫性。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测转基因水稻室内抗虫性CmTre2基因的相对表达量。通过RT-PCR技术检测了转CmTreⅡ基因水稻的遗传性。结果显示:在室外抗虫性试验中,稻纵卷叶螟对水稻的取食量明显下降,转CmTreⅡ基因水稻的卷叶率和白叶率分别为13.40%和12.47%,相比对照组分别下降了11.32%和10.10%;在室内抗虫性试验中,RT-q PCR检测结果表明,稻纵卷叶螟在取食转CmTreⅡ基因水稻的96 h后,CmTre2基因的相对表达量比对照组下降了29.00%;7 d后,实验组的死亡率为56.67%,相比对照组增加了46.67%。在遗传性试验中,检测发现转CmTreⅡ基因水稻的遗传性良好。因此本研究成功鉴定了转CmTreⅡ基因水稻对稻纵卷叶螟的抗虫性以及遗传性。 相似文献
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抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用 总被引:1,自引:1,他引:0
以转基因Bt水稻品种科丰6号为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温30min,通过荧光显色完成对转基因检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cry1Ac基因,其最低定性检测限是传统PCR方法的10倍。本研究建立的针对转基因水稻cry1Ac基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因抗虫水稻的快速检测。 相似文献
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探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。 相似文献