广西地区家蚕品种资源对BmNPV抵抗性的初步调查

以广西地区现有的84个家蚕品种品系为材料,于2龄起蚕经口接种BmNPV,调查不同品种品系对BmN-PV经口感染的抵抗性。结果表明:不同蚕品种间对BmNPV经口感染的抵抗性存在显著差异,供试品种中7532(B)的发病率最低,为21.46%;Z6、中黄4、9497等品种的发病率高达100%;发病率55%以下的品种中绝大多数为日系品种;同一品种不同品系间的抵抗性也有一定的差异。研究结果可为进一步选育抗性品种提供依据。     

云南省部分家蚕品种资源的孤雌生殖发生率调查

家蚕孤雌生殖系在家蚕性别控制、基因纯化及杂种优势产生机制研究等方面有着特殊的应用价值。为了筛选适合云南蚕区饲养的家蚕孤雌生殖系育种材料,以云南省保存的20个家蚕品种(品系)为材料,以温汤处理法处理蚕卵,调查不同品种(品系)的孤雌生殖发生率。供试家蚕品种(品系)中,B黄2的孤雌生殖发生率达77.3%,极显著高于其它品种,而夏芳B的孤雌生殖发生率仅为3.1%,品种间孤雌生殖发生率最大相差74.2个百分点;孤雌生殖发生率40%以上的品种多数为日系品种,且多数日系品种的孤雌生殖发生率在60%以上,中系品种除B黄2外其余品种的孤雌生殖发生率均低于37.0%。相关性分析表明,温汤处理诱导的家蚕孤雌生殖发生率与品种所属地理系统及总卵数都有一定相关性,总体上表现为日系品种较中系品种更易诱导发生孤雌生殖,总卵数高的品种孤雌生殖发生率也较高。     

表达短lef-1dsRNA转基因家蚕对BmNPV的抵抗能力与主要经济性状

为了提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗能力,将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入家蚕卵,经G418和GFP双重筛选并结合分子生物学鉴定,证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄幼虫接种BmNPV,结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕(对照组)下降了10～30个百分点,表明转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高;对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示,2个系统体内的lef-1 mRNA转录水平比对照组平均降低了72倍和26.5倍,最高下降了104倍,进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPV lef-1基因的表达。转基因家蚕的饲养成绩显示其全茧量、茧层量和茧层率等主要经济性状与正常家蚕无明显差异。     

家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。     

亚热带型EGFP荧光绿茧转基区家蚕品系杂交组配试验

为探索EGFP荧光绿茧转基因家蚕品系与常规品种进行杂交时,其F1代的EGFP外源基因在杂交过程中的表达量和稳定性,笔者利用创新育成的亚热带型EGFP荧光绿茧转基因家蚕品系进行杂交组配测试。结果表明：转EGFP家蚕品系与常规白茧品种杂交,外源基因的表达情况有差异,造成绿茧比率各不一样;但利用已经纯合、外源基因表达量高的转EGFP家蚕新品系进行品系间二元杂交,其F1绿茧率高达100％;与常规白茧品种进行二元杂交测试,其F1代绿茧率高达90％以上;与常规白茧品种进行三元杂交测试,其F1代大多组合的绿茧率达到75％以上;测试杂交组合的结茧率、全茧量及茧层率等主要经济性状与两广二号相仿。     

不同家蚕品种对桑叶中1-脱氧野尻霉素的富集能力调查

家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(DNJ)来源于桑叶,为筛选对食下桑叶中DNJ有较强富集能力的家蚕品种用于功能性食品及药物的开发,以18个家蚕品种和6个桑树品种为材料,采用反相高效液相色谱-紫外检测法测定供试家蚕品种5龄第3天幼虫制备全蚕粉中的DNJ含量。不同地理系统家蚕品种对食下桑叶中DNJ的富集能力存在明显差异,其中日系品种与欧系品种对桑叶中DNJ的富集能力有显著差异(前者DNJ质量分数平均为0.3007%,后者为0.2469%),中系品种的DNJ质量分数平均为0.288 0%,与日系品种与欧系品种之间无显著差异;不同眠性(三眠与四眠)家蚕品种间对桑叶中DNJ的富集能力差异不明显。18个供试家蚕品种中,中系品种797对桑叶中DNJ的富集作用最强,其全蚕粉中的DNJ质量分数达0.4345%。选择6个家蚕品种分别取食不同桑树品种的桑叶,分析全蚕粉中的DNJ含量和桑叶中DNJ含量的相关性,其相关系数为0.826 0,全蚕粉中DNJ含量最高的家蚕品种与桑品种组合为家蚕乌2与陕桑403,其次为家蚕武功土种与甜桑、家蚕798与陕桑403。     

萘啶酮酸对家蚕血液型脓病防治效果的研究

以广西现行夏秋用蚕品种两广二号为材料,4、5龄期经口定量添食萘啶酮酸,5龄饷食经口接种BmNPV,调查蚕的发病率、结茧率和茧层率。试验结果表明萘啶酮酸对家蚕血液型脓病有一定的预防效果,使发病率降低40％,并且对养蚕生产安全无毒。     

复方药物NBBJ对蚕病的防治效果试验

蚕病是影响蚕茧产量与质量的主要因素,在养蚕生产上,家蚕血液型脓病(BmNPV病)、家蚕中肠型脓病(BmCPV病)、家蚕白僵病是主要的传染性蚕病。为了防治家蚕传染性蚕病,将丙氧鸟苷、泊沙康唑、金雀异黄酮、尿素等按一定比例配制成复方药物(简称NBBJ),进行了复方药物NBBJ对BmNPV病、BmCPV病、家蚕白僵病的防治效果和对家蚕生长发育及死笼率的影响试验。结果表明,与对照相比,添食复方药物NBBJ的家蚕(药物组),在5龄起蚕经口添食多角体浓度为10~8个/m L、10~7个/m L的BmNPV悬浮液时,BmNPV病发病率分别降低40.00、21.67个百分点,产茧量分别提高了113.80%、43.06%;在5龄起蚕经口添食多角体浓度为10~8个/m L、10~7个/m L的BmCPV悬浮液时,BmCPV病发病率分别降低40.00、34.00个百分点,产茧量分别提高了335.32%、87.09%;在5龄起蚕体喷分生孢子浓度为10~(10)个/m L的白僵菌液时,家蚕白僵病发病率降低61.70个百分点,产茧量提高299.77%。家蚕添食复方药物NBBJ与对照相比,5龄经过基本一致,收茧量高5.42%,全茧量高5.42%,茧层量高5.50%,茧层率差别不大,产茧量和盒种产茧量均提高10.21%,死笼率降低3.31个百分点。家蚕添食复方药物NBBJ可以明显起到抑制蚕病发生,降低死笼率,提高产茧量的作用。     

家蚕母种2龄起蚕添食NPV的抗性试验

家蚕血液型脓病是导致蚕农养蚕减产的主要蚕病之一,提高家蚕品种对NPV的抵抗能力是近年广西家蚕育种的主要攻关课题.设置本试验旨在初步了解家蚕品种对NPV的抵抗能力,以3对强健性、茧丝量等不同的母种进行NPV添毒试验.932、7532是1对高强健性品种,中10、日10是1对茧丝量较高的品种(引进四川省蚕研所882、881经几年改良提高的品系),芙蓉、湘晖是1对强健性、丝量介于上两对之间,初步了解不同强健性的品种对NPV的差异性,为提高家蚕对NPV抗性及NPV抗病育种提供参考.     

家蚕抗血液型脓病新品种华康3号的育成

家蚕血液型脓病是养蚕生产最主要的病害之一,选育家蚕抗血液型脓病新品种对于稳定蚕桑生产具有重要的作用。选择优质高产家蚕品种菁松和皓月作为受体,用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性基因载体品系N作供体,采用杂交、回交(受体作回交亲本连续回交4代)和显性基因纯合固定技术将抗性基因导入受体品种;通过系统选择提高、稳定后代的综合经济性状,育成对家蚕血液型脓病具有高度抵抗性的家蚕新品系并组配成优质、高产新品种菁松N×皓月N(华康3号)。新品种对血液型脓病的抵抗能力比原品种菁松×皓月高10 000倍以上,综合经济性状与原品种菁松×皓月相仿。该品种于2018年3月通过四川省蚕品种审定委员会审定,适合在长江、黄河流域及其他区域饲养。     

增量表达Bmlipase-1的转基因家蚕的主要经济性状调查

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是对养蚕业危害最严重的病原之一,采用传统育种方法培育家蚕抗性品种存在经济性状和抗性呈负相关的矛盾。为了确定转基因方法能否突破该瓶颈,对先前利用家蚕品种大造建立的增量表达内源性抗病毒基因Bmlipase-1的转基因家蚕系统LI-A的主要经济性状进行调查。结果显示,LI-A的4、5龄幼虫逐日体质量及产茧量性状成绩与正常大造之间没有明显的差异,表明转基因抗病毒家蚕系统LI-A在抗性提高的同时,经济性状没有受到影响。     

不同饲料饲养对家蚕抗核型多角体病毒病的能力以及体内3种代谢酶活性的影响

为探讨饲料与家蚕核型多角体病发生的关系及家蚕核型多角体病发生与蚕体内代谢酶活性的关系,研究比较了用桑叶、柘叶饲养的家蚕对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗性以及与抗性相关的羧酸酯酶、碱性磷酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性变化。结果表明:BmNPV对柘叶饲养家蚕的感染中量(ID50)和致死中量(LD50)分别为1.319×105PID/头和1.632×105PID/头,与对桑叶饲养家蚕的ID50和LD50相比,仅为1/2和1/4左右,即柘叶饲养家蚕对BmNPV的抵抗力明显降低;不论用柘叶饲养还是用桑叶饲养的家蚕感染BmNPV后,蚕体内的羧酸酯酶活性均大幅度上升,碱性磷酸酯酶与乙酰胆碱酯酶活性均显著下降,且柘叶饲养家蚕感染BmNPV后体内的碱性磷酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性比桑叶饲养家蚕感染BmNPV后的酶活性更低。     

利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。     

5种家蚕病毒的密码子及密码对使用模式分析

通过分析5种家蚕病毒基因组密码子和密码对使用模式,初步探讨5种家蚕病毒的基因组进化和对宿主的适应策略。采用生物信息学方法对碱基含量(GCall、GC1、GC2、GC3、GC3s)、有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)、密码对(codon-pair)等进行统计分析的结果表明:5种家蚕病毒的密码子偏好性均较低,病毒间的碱基组成及ENc值差异较小,碱基组成对密码子使用模式影响较小;不同病毒选择不同的偏好性密码子,不同病毒的密码对偏好性程度不同,其中,家蚕类葡萄斑点病毒(Bombyx mori macula-like virus,BmMLV)密码对偏好性最强,家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)密码对偏好性最弱。聚类分析表明BmCPV和家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)的密码子使用模式相似,BmNPV和家蚕传染性软化病病毒(Bombyx mori infec-tious flacherie virus,BmIFV)的密码子使用模式相似;BmMLV、BmNPV和BmDNV的密码对使用模式相似,BmIFV和BmCPV的密码对使用模式相似。5种病毒的偏好性密码子和偏好性密码对不同,显示不同病毒的密码子和密码对的进化路径不同,对宿主的适应策略不同。     

应用AFLP分子标记对6个家蚕品种的鉴定

利用AFLP分子标记技术对浙江省生产上应用的 6个家蚕品种 (包括正反交 )进行了DNA指纹分析 ,筛选出E AAC/M CTT、E ACA/M CAA、E ACC/M CTT、E AGG/M CAA及E AGG/M CTT 5对引物。这 5对引物在 6个家蚕品种中共扩增出 15 7条带 (平均每对引物扩增 31 4条带 ) ,其中有多态性带 5 4条 (平均每对引物扩增多态性带 10 8条 ) ,多态性比例为 34 4 %。通过这些多态性条带的不同组合 ,可明确将供试的 6个家蚕品种加以区分 ,并作为 6个家蚕品种鉴定的依据。     

化学诱变的BmNPV对家蚕细胞和虫体感染性的初步研究

前文报道化学诱变剂对家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)多角体形态有明显的诱变作用 ,诱变的BmNPV基因组对某些限制性内切酶的酶切电泳谱发生变化。本文研究进一步表明 :诱变BmNPV感染家蚕Bm N细胞的病变特征与对照相比没有明显不同 ,但形成不定形超大多角体的空斑时间延迟2～ 3d;诱变BmNPV感染家蚕幼虫后 ,病蚕体内各组织病变损害的感染程度 (易感性 )与对照基本相同。研究结果提示 ,诱变的BmNPV对家蚕培养细胞、虫体组织的感染性无显著变化     

利用家蚕生物反应器生产基因工程疫苗的研究

本文就家蚕核型多角体病毒BmNPV的生物学特性及其作为表达载体的优点、家蚕生物反应器的原理、生产程序、特点、优化表达策略以及在基因工程疫苗生产中的应用作了较为详细的阐述。