棉花脂肪酸脱氢酶-2(FAD2)转基因小鼠模型的建立

以pEGFP-N1质粒为基础载体,切除gfp基因的编码序列后,在多克隆位点依次插入动物肌肉α-actin启动子和棉花ω-6脂肪酸脱氢酶编码基因fad2(fatty acid desaturase-2)的cDNA序列,构建成fad2cDNA真核表达载体.用显微注射方法,将线性化的载体DNA注入KM ×B6D2F1小鼠受精卵的的原核内部,然后将胚胎移植到输卵管内,13只受体怀孕产仔.合计移植了286枚受精卵,最后获得34只健康的成年小鼠,PCR方法检测确认5只为阳性小鼠,Southernblot证明只有1只阳性转基因小鼠.     

人肥胖基因(Obese)转基因小鼠动物模型的建立

用三个含有兔乳清酸性蛋白基因(rWAP)启动子,人ob基因(cDNA)及rWAP基因终止子的质粒经亚克隆构建了融合表达载体.用NotI消化表达载体,回收包含上述三个表达元件且插入方向正确的片段(约7.5 kb)并进行显微注射.注射用的DNA浓度为2 g/mL,每mL注射液中DNA的拷贝数约为2.4??011 ,每一枚原核期小鼠胚胎注射1～2 pL.采用标准的显微注射方法,获得48只后代小鼠.四周龄时剪尾并提取尾组织DNA,以人ob基因cDNA为探针,用EcoRI消化总组织DNA,经Southern杂交确证其中两只母鼠为转人ob基因小鼠.在出生的后代小鼠中,转基因阳性率约为4 %(2/48).     

利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究

摘要： 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只（其中2只死胎）,Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。     

毛囊特异表达载体pUHS-FGF18的构建及转基因小鼠的制备

成纤维生长因子18(fibroblast growth factor 18,Fgf18)是一种分泌型的信号分子,参与小鼠(Mus musculus)和绒山羊(Capra hircus)毛发生长及毛周期的调控.本研究克隆了小鼠Fgf18基因CDS区的片段,并将其连接于超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin,UHS)启动子的下游.Sac Ⅰ、BglⅡ、SphⅠ和EcoT14 Ⅰ的酶切鉴定结果表明,成功构建了Fgf18基因毛囊特异表达载体pUHS-Fgf18.原核注射线性化pUHS-FGF18,共获得3只转基因小鼠.RT-PCR检测结果表明,Fgf18基因在转基因小鼠皮肤中的表达明显高于对照小鼠(P＜0.05).转基因小鼠NO.205皮肤中Fgf18的表达量明显高于对照小鼠(P＜0.05),而肝脏、肾脏、心脏、睾丸、骨骼肌、脾、脑、肺、胃和小肠等组织则与对照小鼠无显著性差异(P＞0.05).Westem blot的结果表明,转基因小鼠皮肤的Fgf18蛋白水平显著高于对照组(P＜0.05).同时本研究利用RT-PCR的方法检测了转基因小鼠中Fgf18基因的拷贝数,其拷贝数在8～210.本研究成功建立了毛囊特异表达Fgf18基因的转基因小鼠模型,不仅可为进一步研究Fgf18基因在毛周期及毛发生长中的功能及其作用机理提供必要的工具和手段,也可为生产Fgf18基因修饰的转基因绒山羊提供一定的理论基础.     

转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系

转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法.     

抗草甘膦EPSPS转基因棉花的研究

林敏教授课题组从具有草甘膦抗性的荧光假单胞菌G2中克隆了EPSP合酶基因aroAG2，根据aroAG2的氨基酸序列，按照双子叶植物偏爱密码子人工合成aroAG2M基因。我们利用aroAG2M基因和Impactvector1.4，构建了以菊花Rubisco启动子和叶绿体信号肽驱动aroAG2M基因高效表达的植物表达载体Pim1.4-epsps-plus，以农杆菌介导法转化烟草，转基因烟草经PCR和Southern检测，证明外源基因已整合到基因组中，转基因烟草具有草甘膦抗性。以花粉管通道法转化棉花，经草甘膦抗性筛选得到T1代转基因棉花3株，转基因棉花的PCR和Southern检测结果均为阳性，说明目的基因已通过花粉管通道法导入棉花。     

原核注射制备转基因小鼠的技术优化

原核注射技术已经是目前制备转基因小鼠(Mus musculus)最有效的手段,但不同实验室所报道的转基因效率差异较大,效率不高仍是该技术的主要缺点.为提高转基因小鼠的制备效率,本研究对转基因小鼠制备过程中的原核注射的多个方面都进行了改进,尤其是在注射针直径、外源基因浓度、单/双原核注射以及胚胎移植等主要步骤上的进行了优化.实验结果表明,不同浓度的外源基因对转基因小鼠的阳性率有很大影响.外源基因为1.00、2.50、3.00和4.00 μg/mL浓度时,转基因小鼠阳性率分别0.67％、14.9％、30.6％和21.4％.其中,外源基因浓度在3.00 μg/mL极显著高于其他各组(P＜0.01).采用阳性率最高的3.00 μg/mL浓度又进行了单双/原核注射比较,发现转基因阳性率在进行双原核注射组显著高于单原核注射组(24.3％ vs.18.3％,P＜0.01).将显微注射后的2细胞时期胚胎经输卵管移植到0.5、1.5和2.5d假孕母鼠体内,产仔率分别为68.6％、67.6％和40.1％,转基因阳性率为17.4％、22.5％和10.1％.比较发现,0.5 d与1.5d代孕母鼠产仔率没有差异,但1.5d代孕组转基因阳性率(22.5％)显著高于其他组.结果表明,采用尽可能细的注射针、2～4 μg/mL的DNA载体浓度、双原核注射、1.5d的假孕母鼠和正确的胚胎移植操作,是获得高效率转基因小鼠的关键.本研究对从事动物转基因技术研究的实验室提供一些有益的借鉴.     

植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析*

利用基因重组,将来自于拟南芥（Arabidopsis thaliana)的发生单个碱基突变的als基因插入含有AtNHXI1基因的质粒pCAMBIA1300中,由CaMV35S启动子分别启动AtNHX1和als的表达,得到了兼有除草剂抗性基因和耐盐相关基因的植物表达载体。用烟草叶盘转化法获得了转基因植株。Southern杂交检测表明,外源基因已经整合到烟草(Nicotiana tobacum)基因组中。抗性测定发现,转基因植株除草剂抗性至少提高了1000倍,而耐盐性提高了约1．0％NaCl浓度,即带有同样启动子的不同外源基因赋予转基因植株的抗性程度有明显差异。     

Expression Pattern of Ａ Recombinant Phloem-specific Promoter from Pumpkin in Transgenic Potato Plants

以本实验室构建的重组南瓜(Cucurbita moschata)韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBdENP。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种Favorita，经过抗生素筛选，共获得转pBdENP和对照pBI121的抗卡那霉素马铃薯再生植株106株。通过PCR初步筛查，筛选出65株为转基因阳性植株。通过Southern blot对部分植株进一步分析,确证外源gus基因已经插入到转基因马铃薯植株的基因组中，插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因马铃薯植株进行GUS染色结果表明, dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动gus基因的表达，前者仅在马铃薯的韧皮部内特异表达，而CaMV35S启动子驱动的gus基因为组成型性表达。GUS酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动gus基因表达水平没有明显区别。以上结果证明dENP启动子驱动的外源基因在马铃薯中也具有韧皮部特异而高效表达的特征，从而可用于马铃薯抗病、抗蚜虫转基因研究。     

玉米乙烯应答元件结合蛋白基因启动子克隆与功能验证

为了给玉米转基因研究提供更多的非生物逆境诱导启动子,寻找只在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆基因的表达,在生物信息学分析的基础上,克隆与水稻DREB1B转录因子基因同源的玉米乙烯应答元件结合蛋白基因sb CBF6的启动子psb CBF6,在非生物逆境应答元件分析和实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性后,用以构建驱动报告基因GUS的表达载体,并使用基因枪法转化玉米愈伤组织,通过愈伤组织的GUS荧光值与荧光素酶发光值的比值,评价psb CBF6启动子在非生物逆境胁迫及激素诱导条件下的驱动活性。结果表明,sb CBF6基因在各种非生物逆境胁迫下差异表达。psb CBF6启动子长1 479 bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,可在非生物胁迫条件下驱动外源抗逆基因在转基因植物中诱导表达。试验结果为研究抗逆转基因玉米提了供参考。     

玉米磷酸丙糖转移蛋白（TPT）基因全长cDNA克隆及其在烟草中表达

以玉米黄早四幼苗叶片为材料,通过RT-PCR扩增后获得玉米磷酸丙糖转移蛋白(Triose phosphate translocator．TPT)cDNA 全长片段,对其进行序列分析。结果表明：分离的目的片段核苷酸序列与报道的相比同源率为99.9％,只有1个碱基发生改变。将得到的玉米 cDNA与CaMV35S启动子和NOS终止子融合,构建了正义表达载体,通过根癌土壤杆菌介导转化烟草,转基因植株经PCR和Southern杂交检测,证明TPT基因已整合到烟草基因组上     

germin基因的克隆及其在烟草中的表达

摘要：克隆了具有草酸氧化酶活性的小麦(Triticum aestivum )Germin蛋白的基因，构建了植物表达载体并用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )介导法转化烟草。Southern杂交和酶活性检测表明，germin基因在转基因烟草(Nicotiana tabacum )中得到整合、表达，并正确组合成具有草酸氧化酶活性的同源六聚体蛋白。离体实验表明，外源germin基因的表达提高了转基因烟草离体叶片对草酸的耐受性。     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

宏基因组文库中的组成型启动子在大肠杆菌中的克隆

启动子是决定基因表达水平的重要因素之一。组成型表达启动子被认为是工业上表达重要蛋白质的理想启动子。本研究利用蔗糖为唯一碳源的基本培养基对榨糖废水浸润的土壤微生物宏基因组文库进行筛选,获得两个阳性克隆。对其中一个克隆的柯斯质粒进行亚克隆,利用在线启动子预测和序列比对工具对其中一个亚克隆子进行分析,获得一个启动子序列。然后,利用PCR方法将该启动子和地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因一起克隆到T载体上。结果表明该启动子在不加诱导剂的条件下能够在大肠杆菌中启动外源基因的高效表达。本研究结果为在生物领域中组成型启动子的应用研究提供了基础。     

番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯产量的抑制

筛选番茄幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11，设计引物，利用RT-PCR方法从受到病原浸染的番茄叶片中获得长1018 bp的候选片段，同源性分析发现该片段与其他作物上已发表的ACO基因序列高度同源：同源率从83%~99%，推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上，用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉（RNAi）载体pD311，对番茄进行遗传转化，获得卡那霉素抗性植株27棵，分子检测证实外源片段成功导入其中番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明，RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达，从而导致乙烯的生成大大降低。     

向日葵种子特异性启动子Ha ds10G1的克隆及其功能验证

利用PCR技术从向日葵基因组DNA中克隆了Lea蛋白基因家族中Ha ds10 G1基因上游1414bp的调控序列，序列分析表明-1—1414bp与报道序列同源性为100%，将其与GUS基因融合构建植物表达载体后，通过农杆菌介导法转化烟草NC89，PCR扩增初步证明目的片段已整合到烟草基因组中，转基因植株的GUS活性检测表明，在茎、叶中无GUS活性，GUS活性只存在于种子中，因此，Ha ds10 G1启动子具有种子特异性的功能。     

罗非鱼β-肌动蛋白基因启动子的分离及其转录启动功能检测

采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段。序列分析显示该片段包括长为1643bp的β-肌动蛋白（β-actin）基因5,端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bp的β-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT Box,TATA Box和CArG Box,分别位于转录起始位点上游的-92,-29,-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。该实验为下一步进行转自源基因尼罗罗非鱼的研究奠定了基础。