小麦转录因子基因TaWRKY33的耐盐性分析

【目的】WRKY转录因子是植物转录调节因子家族之一,参与调控植物病原菌的防御、生长发育和抗逆应答等多种生理过程。小麦WRKY转录因子基因TaWRKY33可以提高转基因拟南芥对干旱和高温的抗性。通过分析TaWRKY33的耐盐性,检测TaWRKY33转录因子的转录活性,深入分析转录因子基因TaWRKY33的功能,以解析其耐盐调控机制。【方法】以盐胁迫处理的小麦cDNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测TaWRKY33在盐胁迫条件下的表达模式;将TaWRKY33的CDS序列插入带有CaMV35S启动子的pCAMBIA1302表达载体中,构建表达载体pCAMBIA1302-TaWRKY33,转入农杆菌,侵染野生型拟南芥获得转基因株系;同时利用pWMB110-TaWRKY33双元载体创建了过表达小麦株系。用转TaWRKY33的拟南芥和小麦进行耐盐性鉴定。构建诱饵载体pGBKT7-TaWRKY33,通过单转法将诱饵载体pGBKT7-TaWRKY33重组质粒和文库质粒逐步转化到酵母AH109感受态细胞。通过SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal显蓝反应筛选得到阳性克隆,进行测序和BLAST分析。制备小麦原生质体,通过瞬时表达试验共转化报告子和效应子质粒,计算相对荧光值分析转录因子的转录活性。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,TaWRKY33受盐胁迫的诱导表达。双荧光素酶瞬时表达试验表明TaWRKY33在小麦细胞中可以激活相应荧光素酶的活性。从功能分析,在正常生长条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥没有明显差异;在盐处理条件下,转基因拟南芥的根长大于野生型拟南芥的根长;过表达拟南芥的鲜重大于野生型,呈显著性差异。重要的是,在盐处理下,鲜重、相对电导率和Na+含量表明,过表达TaWRKY33的小麦较其受体对照有更好的耐盐性。对TaWRKY33候选互作蛋白分析表明,这些候选互作蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaWRKY33在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。【结论】小麦TaWRKY33受盐胁迫的诱导表达,具有潜在的转录激活活性,提高了转基因拟南芥和小麦的耐盐性;TaWRKY33可能需要其他蛋白共同作用提高小麦耐盐性。     

胡杨PeREM6.5调控拟南芥水分胁迫耐受机制

  目的  Remorin蛋白是广泛存在于苔藓、裸子和被子植物中的蛋白家族,在调控植物生长发育及生物胁迫反应方面具有重要作用,但有关remorin抵御非生物胁迫作用机制的研究较少。前期研究发现抗逆树种胡杨的remorin 6.5（REM6.5）可通过增强质膜质子泵活性提高植物耐盐性,在此基础上,本文研究了胡杨PeREM6.5在植物耐受水分胁迫中的作用,旨在进一步揭示植物抗旱的生理与分子机制。  方法  以过表达PeREM6.5拟南芥（OE1和OE2）、野生型（WT）和转空载体对照（VC）拟南芥为试验材料,对各基因型拟南芥进行水分胁迫处理（包括渗透胁迫和土壤干旱）以及复水处理,从生理生化及分子生物学角度研究了胡杨PeREM6.5在拟南芥干旱胁迫中的响应机制。  结果  甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥的存活率、根长显著高于WT和VC,并且在渗透胁迫下细胞膜受损程度较小,这些表型差异主要与转基因拟南芥水分吸收、抗氧化防御能力增强有关。甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥水通道基因AtPIP1;2和AtPIP2;1的表达量提高。甘露醇处理诱导WT和VC根细胞积累H₂O₂,对细胞膜造成氧化伤害。转基因株系在甘露醇处理后过氧化物酶基因POD和过氧化氢酶基因CAT表达量显著上调,能维持较高的POD和CAT酶活性,清除H₂O₂及其对细胞膜造成的损伤。在土壤干旱处理9 d后,转基因株系的叶绿素含量下降幅度低于WT和VC,复水后叶绿素含量恢复程度较高。另外,PeREM6.5转基因株系在干旱胁迫下维持PSⅡ实际光合量子产量的能力增强。  结论  过表达胡杨PeREM6.5基因提高了拟南芥对水分胁迫的耐受性。      

胡杨NAC转录因子PeNAC045基因的克隆及功能分析

NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)域蛋白是植物特有的最大的转录因子家族之一,在调节衰老,细胞分裂,木质形成,生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究从胡杨中成功克隆出与胁迫相关的基因,并命名为PeNAC045。测序结果表明,PeNAC045基因编码区长度为915 bp,编码304个氨基酸,与毛果杨PtrNAC045的氨基酸一致性为96.05%。对PeNAC045基因在NaCl和干旱胁迫下的表达情况进行了分析,PeNAC045基因的表达受高盐和干旱的强烈诱导。利用PeNAC045的cDNA全长构建表达载体pBI121-PeNAC045-GFP,测序确认后,将重组结构和阳性对照(空载体)分别转化野生型拟南芥(Col-0),进行亚细胞定位观察,结果显示PeNAC045-GFP融合蛋白定位于细胞核上,并由DAPI进行核染色标定。利用农杆菌花序侵染法将构建的表达载体pCAMBIA1301-PeNAC045转化野生型拟南芥和突变体(ataf2),通过PCR鉴定,获得过表达植株及ataf2/PeNAC045回补株系。对各株系进行NaCl胁迫处理,分析PeNAC045基因的生物学功能。在150 mmol/L NaCl胁迫下,相比于拟南芥突变体和野生型植株,拟南芥PeNAC045过表达株系的萌发率降低,根长变短。此外,拟南芥PeNAC045过表达株系的株高明显低于其他株系,其在苗期对盐胁迫的敏感性增加。研究结果表明,在盐胁迫下,PeNAC045作为转录调节因子,负调控胁迫相关基因的表达。      

过表达胡杨PeRIN4基因拟南芥提高质膜H+-ATPase活性和耐盐性

本文克隆了RIN4(RPM1-interacting protein 4)在胡杨中的同源基因PeRIN4,并在拟南芥中进行过表达,通过研究转基因株系的耐盐表型、质膜H+-ATPsae活性及H+ 、Na+、K+等的动态离子流,揭示了PeRIN4基因在植物响应和适应盐胁迫环境中的作用。利用定位载体pGreen0029-PeRIN4-GFP瞬时转化拟南芥叶肉细胞原生质体的方法,对胡杨PeRIN4蛋白进行亚细胞定位,发现该蛋白定位在细胞的胞质中。耐盐表型实验结果显示,在100 mmol/L NaCl处理下,拟南芥PeRIN4过表达株系(OE1和OE8)的生存率和根长均明显高于野生型(WT)和转空载体拟南芥(VC),说明PeRIN4基因能够提高拟南芥的耐盐性。与WT和VC相比,拟南芥PeRIN4过表达株系质膜H+-ATPsae的活性较高。动态离子流数据显示,在盐胁迫下,PeRIN4过表达株系外排H+和Na+ 离子的能力强于野生型和转空载体拟南芥,然而K+的外流却弱于WT和VC。因此,PeRIN4蛋白具有调节质膜H+-ATPsae活性的功能。拟南芥质膜H+-ATPsae活性的提高主要有两方面的作用:一是可以增强H+泵的质子动力势,驱动Na+/H+逆向转运蛋白,提高Na+外排的能力;二是抑制质膜的去极化,减少K+离子通过去极化激活的外向型K+通道(DA-KORCs)和非选择性阳离子通道(DA-NSCCs)外流,维持了K+/Na+平衡,从而提高PeRIN4转基因拟南芥的耐盐性。      

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

目的长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。方法本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。结果PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P＜0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H₂O₂的含量明显少于野生型。结论本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。      

小麦盐胁迫响应基因TaSRP的克隆及功能鉴定

【目的】土壤盐碱化是制约中国小麦生产的重要因素之一,耐盐性改良成为重要的育种目标。分析小麦TaSRP的功能,解析TaSRP的耐盐性作用机制。【方法】对小麦盐处理转录组测序结果进行分析,发现一个受盐胁迫诱导表达的小麦凝集素类基因TaSRP。根据TaSRP编码的氨基酸序列,通过在NCBI中比对得到水稻、大豆和拟南芥中与TaSRP相似的蛋白序列,利用DNAMAN和MEGA5.05软件进行多重序列比对和同源性分析。根据TaSRP的保守序列设计特异引物,利用TaSRP的实时荧光定量PCR检测TaSRP在不同胁迫处理条件下的表达模式;构建带有CaMV 35S启动子的16318hGFP-TaSRP绿色荧光表达载体,利用瞬时转染法将重组质粒和对照空载体导入拟南芥原生质体,室温黑暗培养16 h,激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光信号;扩增TaSRP启动子序列,利用植物顺式作用元件数据库PLACE（http: //www.dna.affrc.go.jp/PLACE）分析启动子区域中参与非生物胁迫响应的顺式作用元件;将TaSRP的cDNA序列连入带有CaMV 35S启动子的pBI121表达载体中构建pBI121-TaSRP表达载体,转入C5C81农杆菌中,采用蘸花法侵染拟南芥得到转基因株系,并进行耐盐性鉴定。【结果】TaSRP具有EUL保守区,属于卫矛凝集素（EUL）家族,定位在细胞质内。氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,TaSRP与水稻的OSR40类蛋白（OSR40g3、OSR40g2和OSR40c1）的同源性最高;与拟南芥、大豆的同源性较低。TaSRP启动子含有一系列对盐、ABA和低温等非生物胁迫响应的调控元件。实时荧光定量PCR分析显示,TaSRP受ABA和盐胁迫上调表达,对干旱胁迫无明显响应。抗性试验结果显示,在不加NaCl的条件下,野生型与过表达株系总根长基本一致,在125 mmol•L-1 NaCl和150 mmol•L-1 NaCl处理的培养基上,3个转基因拟南芥株系的总根长均大于野生型拟南芥的总根长,并达到显著性差异,表明过表达株系有较好的耐盐性,TaSRP在拟南芥中过表达能够提高拟南芥对盐胁迫的抗性。【结论】TaSRP提高了转基因拟南芥对高盐的抗性。     

超表达杨树RPEase基因促进了拟南芥的生长发育

卡尔文循环是光合作用CO2同化的重要途径,在植物生长发育过程中起着重要作用。磷酸核酮糖3-差向异构酶(RPEase:EC 5.1.3.1)是卡尔文循环再生阶段的一种重要酶类。本文从速生欧美杂交黑杨NE-19中克隆得到RPEase基因,构建植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化野生型和突变体拟南芥,通过普通PCR检测和绿色荧光蛋白(GFP)观测进一步鉴定得到CaMV35S:PdRPE:GFP超表达株系,然后对野生型、超表达株系、突变体和回补株系的生理指标进行测定。结果显示,超表达株系RPEase活性显著升高(P<0.05)。在正常浇水的生长条件下,超表达株系相比于其他3个株系(野生型、突变体、回补株系),气孔数目减少,气孔变大,提高了植物的水分利用效率以及净光合速率,使得超表达株系有更好的生长优势,积累更多的淀粉。在10d的短期干旱条件下,超表达株系的净光合速率和水分利用效率依然显著高于其他3个株系(P<0.01)。因此,研究表明超表达RPEase基因会提高植物生物量的积累以及对短期干旱的抵抗能力。      

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性

目的miR1444b是木本植物特异miR1444家族中的一员,能够参与植物对金属胁迫的响应,但在干旱胁迫响应中的功能尚不明确。方法本实验克隆得到了胡杨MIR1444b基因(peu-MIR1444b)及其启动子(pro-peu-MIR1444b),将peu-MIR1444b基因在模式植株拟南芥中过表达,对转基因植株进行正常浇水、甘露醇模拟干旱和自然干旱条件处理,研究peu-MIR1444b的功能。结果克隆得到的pro-peu-MIR1444b和peu-MIR1444b与Phytozome数据库收录的毛果杨基因组序列相似性分别为99.61%和98.82%。利用PlantCARE数据库分析发现,pro-peu-MIR1444b序列中包含逆境相关的TC-rich repeats元件和受干旱诱导的MYB结合位点MBS。实时荧光定量PCR分析显示miR1444b在转基因拟南芥中表达量显著高于野生型,预测的靶基因葡聚糖合成酶Ⅳ(AT3G14570.2)表达量明显下调,初步确定葡聚糖合成酶Ⅳ在拟南芥中被peu-miR1444b负调控。在250 mmol/L甘露醇模拟的干旱胁迫条件下,转基因拟南芥株系TG-2和TG-5萌发率分别显著高于野生型20.83%和26.67%,根长分别显著高于野生型56.83%和52.60%(P < 0.05)。土壤自然干旱8 d测得转基因拟南芥的光合速率、气孔导度、叶片水分利用效率、PSⅡ最大光化学效率和过氧化物酶(POD)活性均显著高于野生型(P < 0.05)。结论胡杨miR1444b可以促进根系生长增加植物的吸水能力,负调控葡聚糖合成酶Ⅳ提高植物的渗透调节能力,维持植物在水分亏缺条件下的光合效率,保证植株正常生长,在拟南芥中正调控植物抗旱性。      

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能,为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析,预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性,并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX,运用农杆菌介导法,将ZjGPX转入拟南芥,对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp,编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明,在辣椒枣组培苗中,ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达,且反应迅速,仅胁迫15 min,其相对表达量与对照相比即出现大幅升高,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察,共获得10株阳性转基因拟南芥株系,干旱及盐胁迫处理结果显示,转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥;成株在胁迫15 d后,野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象,而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用,过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。     

异源表达Peu-miR473 a增强拟南芥的抗旱性

为了探究胡杨miR473a基因的功能,本文克隆了miR473a的前体Pre-Peu-miR473a,并利用农杆菌花序侵染法将其遗传转化入拟南芥。通过普通PCR和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色检测获得CaMV35S: miR473a过表达植株,然后对转基因和野生型植株在甘露醇模拟高渗环境与土壤自然干旱条件下的生长状况及各项生理指标进行评价。结果表明,胡杨miR473a前体长度为100 bp,与毛果杨前体序列相似度为100%,可以形成完美的二级茎环结构。相比于野生型,过表达胡杨miR473a的拟南芥在200 mmol/L甘露醇胁迫条件下的萌发率、根长和生长状况都优于野生型;在土壤干旱处理条件下,转基因拟南芥的株高、相对含水量、脯氨酸含量以及光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光合效率均显著高于野生型10%以上(P0.05)。半定量PCR检测显示:Peu-miR473a参与胡杨受干旱胁迫的正调控,杨树中预测的靶基因Potri.012G093900、Potri.007G100200、Potri.009G165300、Potri.004G204400受干旱胁迫的负调控;拟南芥中预测的靶基因AT1G24530、AT5G45000、AT5G46070及AT3G52950在转基因株系中表达量下降。初步预测它们有可能被miR473a靶向调控。本研究表明,miR473a基因在干旱胁迫条件下通过调控植株的抗脱水能力和渗透调节能力发挥一定抗旱作用。      

bZIP转录因子与植物抗逆性研究进展

碱性亮氨酸拉链(Basic region/leucine zipper motif,bZIP)类转录因子是近年来研究较多的转录因子家族之一,参与多种生物学过程,对植物的抗病性、抗寒性、抗旱性和耐盐性等逆境均具有重要的调控作用.文章通过对植物bZIP类转录因子的分布、结构、分类及其在植物逆境胁迫中的作用等最新研究进展进行了综述,提出今后可在全基因组层面上发掘更多的bZIP转录因子,并通过定点突变、转基因等手段创造bZIP的突变体,促进对bZIP表达调控机制的认识,进而了解bZIP转录因子对抗逆相关基因的调控机理,并通过基因工程手段提高植物的抗逆性,培育多抗性植物新品种.     

植物bZIP转录因子在非生物胁迫中的作用

非生物胁迫因子如干旱、高温、低温和盐碱等严重影响着植物的生长发育,碱性亮氨酸拉链(bZIP)类转录因子与非生物逆境胁迫响应有密切关联。综述了植物bZIP类转录因子在应答非生物逆境胁迫中的作用及研究进展。     

胡杨对干旱胁迫适应机理的研究进展

综述了胡杨抗旱特征特性及其对水分胁迫的响应,探讨了胡杨的抗旱机理,并提出了胡杨抗旱研究领域应重点开展的工作。     

梭梭HaNAC12转录因子抗逆功能验证

【目的】验证梭梭NAC转录因子基因（HaNAC12）的抗逆功能,以期解析梭梭响应逆境胁迫的分子机制,为梭梭及其他作物抗逆遗传改良提供理论参考。【方法】通过实时荧光定量PCR对HaNAC12基因在干旱、高盐、ABA处理下的表达模式分析。利用同源重组法、农杆菌介导喷花法、喷洒除草剂等方法构建并筛选HaNAC12转基因拟南芥...     

PtrDREB28转录因子的克隆及抗逆性

DREB/CBF转录因子响应植物干旱、高盐和低温等非生物胁迫应答是通过特异结合DRE/CRT顺式作用元件。利用RT-PCR技术从毛果杨克隆PtrDREB28转录因子基因,用基因枪法对其进行亚细胞定位分析,结果表明其定位在细胞核中;利用农杆菌介导法对野生型大青杨进行遗传转化,并对转基因株系进行抗逆性分析,结果显示经高盐胁迫处理的转基因株系的耐受性明显高于野生型植株;通过测定和比较经盐胁迫处理后转基因株系和野生型植株的丙二醛质量摩尔浓度和相对电导率,发现转基因株系的丙二醛质量摩尔浓度和相对电导率均显著低于野生型植株,表明PtrDREB28基因的过表达可以显著提高杨树耐盐性,由此推测PtrDREB28转录因子可能参与杨树逆境胁迫应答过程。     

三种植物气体交换参数的日变化特征

以三工河流域3种植物胡杨(Populus euphratica)、芦苇(Phragmites communis)和柽柳(Tamarix chinensis)为研究对象,利用LI-6400便携式光合作用测定系统测定了3种植物的光合速率、蒸腾速率、气孔导度等气体交换参数,分析3种植物对不同土壤条件的响应以及植物水分利用效率和光能利用效率的日变化特征。结果表明,1芦苇对不同的土壤环境适应能力最强,胡杨主要受水分影响,柽柳受到水盐及其他环境要素的共同影响,适合于水盐不要过高的地方;2芦苇和胡杨的水分利用效率在水分充足时低于水分较低时,而柽柳的水分利用效率变化随土壤水分变化不大;33种植物的光能利用效率均随水盐含量减少而增加。芦苇在不同生境中均表现极强的生态适应性,胡杨的生理特性和分布范围主要受水分影响,柽柳在水盐生境中也表现为极强的适应性,其主要受干旱胁迫作用,在胁迫生境中3种植物主要通过提高自身的光能利用效率来抵御胁迫危害。     

干旱胁迫下不同胸径胡杨生理特点分析

以三个典型样地中不同胸径胡杨下部披针形叶片为实验材料,对其光合色素含量、水分含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量进行了测定.结果表明:随着水分胁迫的加剧,不同胸径胡杨类胡萝卜素、胡萝卜素/叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量均呈上升的趋势.而叶绿素b、脯氨酸含量在不同土壤水分条件下变化不同,表现为轻度胁迫时含量增加,重度胁迫时含量急剧减少.不同胸径间胡杨的各项生理指标大致表现为随着胸径的增大含量逐渐升高的趋势.研究表明:在一定的水分胁迫下,胡杨可以通过生理过程不断调整自身的抗旱能力,但当胁迫加重时,胡杨的生理活动便遭到一定程度的破坏.在5～30 cm,胸径越大的胡杨,忍受胁迫的能力越强.