两种诱变处理对紫花苜蓿种子萌发及植株生理生化特性的影响

为了研究诱变处理对紫花苜蓿(Medicago sativa)种子萌发及植株生理特性的影响,以紫花苜蓿Wega7F种子为供试材料,经~(60)Co-γ和甲基磺酸乙酯(EMS)两种诱变处理后,测定种子萌发、幼苗生长及植株生理指标。结果表明,不同剂量~(60)Co-γ射线处理对苜蓿萌发率、发芽指数、幼苗生长的影响不同,低剂量(150Gy)提高了发芽率、发芽指数及幼苗生长,高剂量(300和450Gy)抑制萌发率和幼苗生长。EMS处理均抑制苜蓿种子的萌发及幼苗生长。在低剂量条件下,~(60)Co-γ射线处理对株高有促进作用,高剂量会抑制植株生长;EMS处理则抑制苜蓿株高生长。两种诱变处理均促进苜蓿分枝,且低剂量处理下均有利于提高苜蓿单株鲜草产量。在~(60)Co-γ辐射和0.4%EMS处理下,叶绿素含量提高,其他处理叶绿素含量均降低。诱变提高了苜蓿叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,对3种酶活性的影响程度表现为PODCATSOD。本研究结果表明,150Gy ~(60)Co-γ对苜蓿产量及株高影响显著,为苜蓿生产应用提供了一定利用价值;EMS处理更有利于增强苜蓿分枝能力,有利于苜蓿在观赏方面的提高及改良。     

新鲜、玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化模式初探

旨在初步分析新鲜及玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化模式。本研究采用单细胞全基因组甲基化测序技术(scWGMS)检测新鲜、玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化水平和差异甲基化区域(DMR),探讨两者之间DNA甲基化水平上的差异。结果表明,新鲜卵母细胞体外受精囊胚的整体甲基化水平显著高于玻璃化冷冻卵母细胞体外受精囊胚的整体甲基化水平(P<0.05)。采用基因本体分析(GO)和相关信号通路(KEGG)对143个DMRs分析,发现生物学过程主要显著富集在新陈代谢、生长发育、细胞定位、细胞刺激反应等,通路主要富集在生长发育、核酸结合及组蛋白乙酰化上,并筛选出几个与之相关的候选基因(FARP2、PI4KA、FAM3D、NCOR2、ZNF827等)。本研究初步发现,玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚的全基因组甲基化水平显著降低,且DMR区域主要集中在ATP结合、生长发育及组蛋白乙酰化,为提高玻璃化冷冻卵母细胞体外受精囊胚质量提供信息参考。     

冷冻保存对猪耳成纤维细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化和基因表达的影响

为探索冷冻保存对猪体细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化的影响,本研究以梅山猪耳成纤维细胞为材料,采用亚硫酸氢盐测序和RT-PCR技术,检测了新鲜和冷冻保存细胞中H19和IGF2R基因的DNA甲基化状态和表达量,并对甲基化相关基因的表达水平进行分析。结果表明:冷冻组中H19基因DMR1和DMR3的甲基化率极显著高于新鲜组(P0.01),H19基因DMR2表现为去甲基化,极显著低于新鲜组中的甲基化率(P0.01),且该基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01);冷冻组IGF2R基因DMR2表现为超甲基化,冷冻组极显著高于新鲜组中的甲基化率(P0.01),但IGF2R基因表达量无显著差异(P0.05);冷冻组中DNMT3A和DNMT1的基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01),DNMT3B基因表达量则无显著差异(P0.05)。本实验条件下,冷冻保存影响了H19和IGF2R基因甲基化控制区的DNA甲基化状态,从而影响了该基因的表达水平。     

不同诱变处理对苜蓿叶片细胞显微和超微结构的影响

研究⁶⁰Co-γ射线、紫外线、零磁空间和EMS诱变处理下苜蓿SP1代叶片细胞显微、超微结构的变化,筛选最优诱变处理,选育适合高寒地区种植的苜蓿新品系或品种。以公农1号、Wega7F、WL319HQ、敖汉4个苜蓿品种试验材料,设置⁶⁰Co-γ射线150、300、450 Gy射线强度,紫外线30、60、90 min照射时间,甲基磺酸乙酯(EMS) 0.1%、0.2%、0.4% (v/v) 溶液浓度,零磁空间处理180 d;测定苜蓿叶片细胞显微和超微结构。不同诱变处理后4个苜蓿品种叶片厚度均不同程度增加,其中公农1号EMS 0.4% (v/v)浓度下,叶片厚度最大,为446.16 μm,增厚幅度达到25.86%,同时诱变降低了叶脉突起程度;公农1号⁶⁰CO-γ辐射和紫外线处理细胞结构疏松度均高于对照,诱变后Wega7F细胞结构紧密度升高;EMS处理下海绵组织厚度均降低;低剂量诱变处理下[150 Gy ⁶⁰Co-γ,30 min紫外线,0.1% (v/v) EMS],细胞叶绿体出现变形、基粒片层松散、类囊体解体、脂质球增多等现象,高剂量处理[450 Gy ⁶⁰Co-γ,90 min紫外线,0.4% (v/v) EMS]和零磁空间处理下,叶绿体膜会有部分模糊或解体,基粒片层膨胀或模糊、基粒垛叠程度变化随诱变处理种类增加或降低。4种苜蓿品种的叶片厚度诱变后叶片厚度均增加。在一定梯度范围内,⁶⁰CO-γ射线和EMS诱变效率较高,突变体材料丰富,操作简单,适宜诱变育种的实际操作;150 Gy, ⁶⁰Co-γ射线、60 min紫外线、0.4%浓度EMS处理为苜蓿正向变异处理,有利于筛选有益诱变突变体。     

辛基酚对雄性大鼠精子印记基因(Igf2,Peg3)DMR区CpG岛甲基化的影响

为了观察辛基酚(OP)对雄性大鼠精子印记基因(Igf2,Peg3)DMR区Cp G岛甲基化的影响,试验采用给青春期大鼠口服辛基酚28天及停药天后35天分离大鼠附睾尾部成熟精子,提取DNA,应用亚硫酸盐处理测序的方法检测精子印记基因(Igf2,Peg3)DMR区Cp G岛甲基化状态。结果表明:辛基酚没有影响Peg3 DMR区甲基化模式的改变,但Igf2 DMR2区非甲基化程度有所提高。辛基酚可导致精子印记基因Igf2 DMR2区甲基化状态异常,具体表现为Cp G位点中胞嘧啶甲基丢失,但并没有影响母源印记基因Peg3的非甲基化状态。     

基于MeDIP-seq研究蛋氨酸对巨噬细胞炎症中甲基化水平的影响

本课题组前期已研究表明蛋氨酸(Met)能缓解脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞的炎症反应,但其调控的分子机制尚不明确。本研究旨在从甲基化角度初步探讨DNA甲基化与Met抑制LPS诱导巨噬细胞炎症中分子机制的相关性。应用全基因组甲基化测序技术(MeDIP-seq)检测空白组、LPS组和LPS+Met组细胞的全基因DNA,每组3个重复。结果表明:LPS组甲基化峰(peak)的数量、总长度和覆盖率均高于空白组和LPS+Met组;与空白组相比,LPS组的高甲基化基因数在不同基因功能元件上均多于低甲基化基因数;与LPS组相比,Met+LPS组的低甲基化基因数在不同基因功能元件上均多于高甲基化基因数。运用GO富集和KEGG分析发现,LPS组与LPS+Met组差异甲基化基因主要富集在单一生物过程(Single-Organism Process)和细胞过程(CellularProcess),信号通路主要富集在Hippo信号通路。本研究为Met调控机体免疫和炎症反应提供一定的科学依据。     

克隆猪印迹基因IGF2/H19印迹控制区的甲基化状态

为了探求核移植过程中DNA甲基化重编程是否充分,运用亚硫酸氢盐测序法分别检测新生死亡克隆猪和同期正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中IGF2/H19基因印迹控制区(DMR1、DMR2、DMR3)的甲基化状态。结果发现,DMR1、DMR3在克隆猪和正常猪各组织中的甲基化水平不同,但差异不显著(P＞0.05)。DMR2在克隆猪肺脏组织表现为超甲基化,极显著高于正常猪(P＜0.01),且10个测序克隆中存在2处连续的全甲基化CpG位点(分别为4－9位和12－17位),而在其它组织中甲基化差异不显著(P＞0.05)。说明DMR2在克隆猪肺脏组织可能存在DNA甲基化重编程紊乱,这也可能是导致该克隆猪死亡的因素之一。     

尖叶石竹种子的EMS和60Co-γ诱变

为了获得更多尖叶石竹(Dianthus spiculifolius)新品种,本研究利用EMS和~(60)Co-γ射线对尖叶石竹种子进行了诱变处理。结果显示,处理时间为16h时,1.0%的EMS浓度接近诱变的半致死剂量,变异率达到7.0%。当剂量率为0.1Gy·min~(-1)时,300Gy的~(60)Co-γ射线接近诱变的半致死剂量,变异率达到4.2%。通过表型观察共获得了1 038株M1代变异植株,其中,EMS诱变处理获得了95株,~(60)Co-γ射线诱变处理获得了943株。本研究为丰富尖叶石竹种质资源提供了帮助,而且为石竹属其他植物的诱变研究提供了技术参考。     

不同性别大白猪肌肉全基因组高分辨率单碱基甲基化差异分析

旨在通过不同性别大白猪的全基因组高分辨率单碱基甲基化差异分析,检测差异甲基化区域(DMR)和差异甲基化基因(DMG),为进一步解析公母猪骨骼肌发育差异奠定基础。本研究采用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术分析了4头210日龄长白猪(公、母各半)背最长肌全基因组DNA的甲基化程度和差异甲基化区域,探讨性别间DNA甲基化水平的差异。结果表明,全基因组范围约有5%的胞嘧啶(C)发生了甲基化(mC);母猪和公猪的总体甲基化水平基本一致。共检测到1 629个DMRs和841个DMGs。母猪的DMRs平均甲基化水平明显高于公猪。通过基因本体分析(GO)和相关信号通路(KEGG)分析,共检测到171个GO条目和10个信号通路,显著富集在轴突导向、细胞连接、细胞粘附、ECM受体互作等相关过程中;筛选出5个与不同性别肌肉调节相关的候选基因。本研究绘制了不同性别大白猪的高分辨率单碱基全基因组甲基化图谱,为不同性别表观遗传研究以及肌肉发育和肉质相关候选基因的筛选提供了信息参考。     

鸡繁殖性能近交衰退相关CpG岛差异甲基化基因的筛选

鸡繁殖性能近交衰退是地方鸡遗传资源活体保种过程中面临的重要问题之一,本研究旨在探讨全基因组CpG岛（CpG island,CGI）区DNA甲基化在鸡繁殖性能近交衰退中的作用。分别从狼山鸡高近交组和低近交组中各选取健康母鸡3只,即试验分2个组,每组3个重复,然后采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术,检测分析两组个体性腺轴组织（包括卵巢和下丘脑）全基因组DNA甲基化差异,筛选差异甲基化区域（DMRs）,并对CpG岛区差异甲基化基因进行功能注释和富集分析。结果表明,狼山鸡高近交组和低近交组比较,其卵巢和下丘脑基因组整体甲基化水平均不存在显著差异（P>0.05）;高、低近交组间差异甲基化区域检测发现,下丘脑和卵巢中分别检测到5 948和4 593个差异甲基化区域,其中1 798和995个差异甲基化区域位于基因组CpG岛区,分别注释到1 020和552个基因;下丘脑中,这些CpG岛区差异甲基化基因显著富集在信号转导、神经系统发育、生殖系统发育和卵母细胞成熟调控等繁殖相关的GO条目,以及转化生长因子β信号通路、乙型肝炎、脂肪酸代谢、胰岛素信号通路等19条KEGG信号通路（P<0.05）;卵巢中,CpG岛区差异甲基化基因显著富集于12条信号通路（P<0.05）,包括慢性骨髓白血病、流感A、精氨酸和脯氨酸代谢、粘着连接等,一些与卵子发育和性激素分泌相关的信号通路也被富集到,如黄体酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、GnRH信号通路、雌激素信号通路等,其中包含CDC27、ADCY8、AKT3等10个差异甲基化基因。因此,本研究在狼山鸡高、低近交组间检测到了大量差异甲基化区域,并发现大量差异甲基化基因与繁殖性状相关,推测这些基因CpG岛区DNA甲基化可能在狼山鸡繁殖性能近交衰退调控中发挥重要作用,研究结果为进一步深入探索鸡繁殖性能近交衰退调控机制奠定了基础,为物种资源保护和家禽育种工作提供了理论参考依据。     

空间飞行和60Co-γ射线辐照对苦荬菜种子的细胞学效应研究

利用返回式卫星搭载苦荬菜(Lactuca indica)干种子,研究比较其与用不同剂量γ射线辐照对苦荬菜根尖细胞的遗传学效应。实验结果表明:与地面对照组相比,种子空间飞行可促进根尖细胞有丝分裂;而γ射线则抑制根尖细胞有丝分裂,并随着辐照剂量的增加有丝分裂指数逐步下降。二者均可诱发根尖细胞产生微核、染色体断裂、染色体粘连、落后染色体、游离染色体、桥等畸变。但空间飞行诱发畸变的频率明显低于γ射线辐照。在γ射线辐照剂量0～30Gy范围内,随着剂量的增加,单微核、多微核和染色体总畸变频率逐步升高。     

60Co-γ射线辐照对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的影响

为阐明⁶⁰Co-γ射线辐射对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的影响,本研究采用⁶⁰Co-γ射线不同辐照剂量(100,200,300,400,500Gy)对粉黛乱子草种子进行辐射处理(以无辐照处理为对照),分析粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长相关指标对不同辐射处理的响应。结果表明,随着辐射剂量的提高,发芽率、发芽势和发芽指数都呈现先上升后下降的趋势;低剂量辐射提高了胚芽长度,而胚根长度则随着辐射剂量的提高呈逐渐降低的趋势。经辐射处理的幼苗株高、根长、叶宽、叶片数及绿叶数均低于对照。随着辐射剂量升高,根系的总长和表面积呈现先增加后降低的趋势,而根系总体积呈逐渐降低趋势,根系平均直径受辐射剂量影响较小。线性回归分析结果表明,粉黛乱子草干种子⁶⁰Co-γ射线的半致死剂量约为274Gy。本研究可为粉黛乱子草辐射诱变育种研究提供参考。     

60Co-γ射线对青绿苔草种子萌发及幼苗生长的影响

为探究不同剂量⁶⁰Co-γ射线辐射对青绿苔草种子萌发及幼苗生长的影响,筛选青绿苔草种子适宜的辐射剂量,本研究以青绿苔草50%相对成苗率作为确定半致死量的标准,对青绿苔草种子进行⁶⁰Co-γ射线辐射处理,辐射剂量分别为0(对照),75,100,150,250,450和650Gy。结果表明,随着辐照剂量的增加,青绿苔草种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、成苗率以及幼苗的苗高和根长均逐渐降低;根据种子的相对成苗率,初步确定青绿苔草种子的适宜辐射剂量(半致死剂量)约为138Gy。本研究以期为今后利用⁶⁰Co-γ射线辐射诱变技术对青绿苔草进行种质创新和新品种培育提供理论依据。     

60Co-γ辐射对谷稗幼苗生长和微量元素吸收的影响

用不同剂量⁶⁰Co-γ辐射对‘朝牧1号’谷稗（Echinochloa crusgalli）种子进行处理,研究⁶⁰Co-γ射线辐射对谷稗幼苗生长和微量元素含量的影响。结果表明：50~200 Gy辐射组促进了最长根的生长,但抑制了幼苗株高和总长度;随着辐射剂量的增加,茎叶Fe、Mn、Zn、B、Ni元素含量和根部B元素含量呈先增后减趋势,根Fe、Mn、Ni元素含量随辐射剂量增加而呈增加趋势,Zn元素含量呈降低趋势。     

PEG胁迫对经60Co-γ辐射无芒雀麦种子的幼苗叶片超微结构的影响

为明确⁶⁰Co-γ射线对干旱条件下无芒雀麦（Bromus inermis）叶片的影响,从而为无芒雀麦利用辐射进行抗旱育种提供理论依据,本试验应用透射电镜观察聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）模拟干旱胁迫下的⁶⁰Co-γ射线辐射无芒雀麦的叶片细胞,比较辐射对无芒雀麦叶片细胞、叶绿体、线粒体的形态和超微结构的影响。试验结果表明：未受辐射和PEG胁迫的无芒雀麦叶片细胞形态规则,叶绿体基粒片层和基质片层多且有序,线粒体膜完整,内嵴清晰,基质浓厚。10% PEG胁迫50 Gy辐射处理组叶片细胞扭曲最严重,形态不规则,细胞壁厚度不均,质膜内陷,有轻微质壁分离。10%和20% PEG胁迫下辐射剂量为50 Gy时,叶绿体和线粒体形态和超微结构受影响程度较轻,随着干旱胁迫强度和辐照剂量的增加,叶绿体和线粒体超微结构受损伤程度增强;20% PEG胁迫下辐射剂量为200 Gy时,叶绿体膜有不同程度破损,基粒片层排列的紊乱性增加,部分基粒片层不清晰,基质类囊体片层结构清晰,可见少量淀粉粒;线粒体膜破损比较严重,内嵴减少,排列不规则,基质较浅。可见,不同⁶⁰Co-γ射线辐射剂量可对无芒雀麦叶片叶绿体和线粒体超微结构产生不同程度的影响,在利用⁶⁰Co-γ射线辐射进行无芒雀麦耐旱性育种时,可选择50 Gy低辐射剂量结合20% PEG模拟干旱胁迫进行抗旱性突变体的筛选。     

杂交狗牙根诱变后代综合评价

辐射育种是一种获得优良品种的快速有效的植物育种方法。本试验采用9000和11300 rads的⁶⁰Co-γ射线,对8份杂交狗牙根(Cynodon dactylon×C.transvaalensis)的匍匐茎和根状茎进行辐射诱变,从坪用价值、抗寒性和生长速度3个方面对亲本及21个后代进行综合分析与评价,以选育出坪用价值高、生长速度快且抗寒性强的优良狗牙根新种质。结果显示:诱变使狗牙根的坪用性状发生了丰富的不定向的变异,同一亲本通过诱变既可以产生良性变异,也可以产生劣性变异;综合评价结果选育出坪用价值优良的诱变后代3份,分别为C75104M2-1/1,C75502M1和C75103M1-1,其抗寒性半致死温度分别为-0.51,-3.54和-3.67℃,其中C75502M1为坪用价值高且生长速度快的优良诱变后代。     

60Co-γ辐射种子处理对‘龙牧806’苜蓿幼苗耐盐性的影响

为了探究⁶⁰Co-γ辐射对NaCl胁迫的‘龙牧806’苜蓿（Medicago sativa×Meliloides ruthenica ‘Longmu 806’）幼苗生理生化指标的影响,本试验对苜蓿种子进行不同剂量（600 Gy,900 Gy,1 200 Gy和1 500 Gy）的⁶⁰Co-γ辐射处理,测定NaCl胁迫下苜蓿幼苗的叶片和根的可溶性蛋白（Soluble protein,SP）、脯氨酸（Proline,Pro）、可溶性糖（Soluble sugar,SS）、过氧化物酶（Peroxidase,POD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和相对电导率（Relative conductivity,RC）。结果表明：苜蓿叶片和根的SP,Pro和SS含量及POD和PPO活性均随辐射剂量的增加呈先升后降的趋势,在600 Gy辐射组达到最高值;MDA含量和RC随辐射剂量的增加呈逐渐升高的趋势,在1 500 Gy辐射组均达到最高值。相关性分析结果表明：叶中Pro与SP,POD均呈极显著正相关,根中POD与SP呈极显著正相关,而叶和根中MDA与RC均呈显著正相关。苜蓿幼苗的叶片和根对NaCl胁迫各指标的隶属函数进行综合分析得出,不同辐射处理苜蓿种子的幼苗对NaCl抗性由强到弱依次为：600 Gy > 0 Gy > 900 Gy > 1 200 Gy > 1 500 Gy,600 Gy辐射剂量能有效提高‘龙牧806’苜蓿对NaCl的抗性,是诱变育种的合适剂量。     

dsRNA和Aza-CdR转染猪肾细胞的全基因组差异甲基化区域分布特征的比较

本研究旨在通过比对PolyI：C和Aza-CdR转染猪肾细胞后全基因组差异甲基化峰的分布特征，进而筛选Gene Ontology （GO）特有的差异甲基化基因，分析差异甲基化区域。首先，基于MeDIP-chip技术，采用猪385 K全基因组启动子和CpG岛甲基化芯片，分析3组试验材料（病毒模拟物Poly I：C转染的猪PK15细胞、甲基化酶抑制剂Aza-CdR转染的PK15细胞、无处理的mock细胞），通过Peak DM Value和Peak Score值获得试验组间显著性富集的差异甲基化峰；其次，对差异甲基化基因进行GO注释，筛选差异甲基化区域和差异甲基化基因。最终结合Bisulfite克隆测序和mRNA荧光定量表达试验验证差异甲基化区域DMR。试验初步揭示猪肾细胞全基因组DNA甲基化主要分布于5'调控区域。试验在组间比较后，特别是在P vs.C和A vs.C比较中发现DNA甲基化在基因组上的分布特征与CpG岛密度与距离TSS的位置有关，而在近启动子区域（0―+200 bp） DNA甲基化显著影响基因的表达。Poly I：C对PK15作用使得TSS附近200 bp （-200―+500 bp）低甲基化启动子增多，说明Poly I：C与Aza-CdR的作用相似，均具有潜在的去甲基化作用，特别是位于猪14号染色体上BNIP3L基因的10459946―10460615 bp区段共有669 bp Peak Length CG位点发生去甲基化。研究揭示，PolyI：C和Aza-CdR并不是对猪所有基因具有去甲基化作用，主要针对特有基因的特有启动子，证明这些特有启动子的CpG岛对Poly I：C和Aza-CdR具有特别的敏感性。