H19和IGF2R基因在体细胞克隆猪各组织中的甲基化状态

为了探求新生克隆猪可能的死亡原因以及是否存在不完全的DNA甲基化重编程,本试验运用亚硫酸氢盐测序法分别检测了H19基因和IGF2R基因差异甲基化区（DMR）在新生死亡克隆猪和同期正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的甲基化状态。结果发现,H19基因DMR在克隆猪肺脏中表现为超甲基化,极显著高于正常猪（95．20％VS46．80％P〈0．01）,且10个测序克隆中存在2处连续的全甲基化CpG位点（4-9位、12-S17位）,而在其他组织中甲基化差异不显著（P〉0．05）;IGF2R基因DMR在肝脏中处于超甲基化状态,显著高于正常猪（80．00％V839．41％P〈0．05）,而在肺脏中为去甲基化状态,板显著低于正常猪（14．71％VS66．47％P〈0．01）,在其他组织差异不显著（P〉0．05）。结果说明,在死亡克隆猪中,H19基因DMR在肺脏和IGF2R基因在肝脏与肺脏中存在不完全的DNA甲基化重编程,这可能是导致克隆动物死亡的因素之一。     

体细胞核移植技术生产猪植酸酶转基因胚胎的研究

为获得具有植酸酶腮腺特异性表达的猪转基因克隆胚胎,本研究使用植酸酶腮腺特异性表达的DNA质粒(包含腮腺分泌蛋白(parotid secretary protein,PSP)启动子与终止子序列、Neo筛选基因、绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和高比活的植酸酶appA基因),采用脂质体转染和基因素418(G418)药物抗性筛选的方法获取稳转细胞系,并利用体细胞核移植技术获得植酸酶转基因胚胎。结果表明,本研究构建的DNA质粒可用于细胞筛选,且质粒越小,细胞的转染效率越高,14.89 kb的YM6552仅获得了7.1%的转染率,EGFP质粒则获得了43.4%的转染效率。在单克隆形成上,较小的pYN3600也获得了更高的单克隆形成数(25个),其中表达EGFP的单克隆有14个,植酸酶PCR阳性集落有11个,高于YM6552的单克隆数(19、8和6)。转基因细胞构建重构胚胎后,所有的胚胎均能表达绿色荧光蛋白,虽其体外发育能力有所下降,但差异不显著(P>0.05)。综上所述,本研究所采用的植酸酶质粒、细胞筛选方法和核移植技术可生产植酸酶重构胚。     

乡村振兴战略背景下“两全两高”农业机械化发展的实现路径研究

本文以乡村振兴战略为背景,坚持农村农业优先发展,产业兴旺、生态宜居、乡村文明、治理有效、生活富裕的要求,全面描述了发展“两全两高”农业机械化的重要意义,从现实出发以山东省某市为例,结合该市县区过去几年“两全两高”农业机械化开展现状,分析了农业机械化在水稻、大蒜地区开展水平不高,丘陵山区、湖区机械化水平低,农业机械化社会服务组织培育滞后等困难,提出了“两全两高”农业机械化发展需要政府参与,加大对农业机械化政策资金的倾斜,多部门合作促进农机农艺融合,多渠道加大“两全两高”农机化宣传,加强农田基础设施建设,加大农机社会化服务组织扶持力度等几点建设,以加快推进农业农村现代化。     

电激活前亚胺环己酮预处理对猪孤雌激活胚发育的影响

本研究的目的是检测电激活前亚胺环己酮(CHX)预处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活及随后胚胎发育的影响。试验结果表明:去卵丘卵母细胞最佳电激活参数为120 V/mm,40μs,1DC。卵母细胞在含CHX(10mg/mL)的NCSU-23中处理10min获得的囊胚率最高,显著高于处理0、30、40min组。电激活前,用CHX预处理较短时间可提高体外成熟卵母细胞孤雌激活胚的发育能力。     

谷氨酰胺与鸡卵黄低密度脂蛋白提高猪精液冷冻效果的研究

为提高猪精液冷冻保存效果,在9％鸡卵黄低密度脂蛋白(LDL)冷冻稀释液的基础上,研究了添加不同浓度的谷氨酰胺对猪精液冷冻效果的影响.结果表明:在LDL冷冻稀释液中添加谷氨酰胺可显著提高猪精子冷冻效果(P＜0.05),较适宜添加量为40 mmol/L.     

3种冷冻方法对猪MⅡ期卵母细胞线粒体分布和损伤的影响

本研究旨在探讨3种冷冻方法对猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻后线粒体的分布和超微结构变化的影响.通过透射电镜、Rhodamine-123 (R-123)荧光染色和体外发育观察,结果显示,(1)无论是FDA-DAPI复染存活率,还是孤雌激活卵裂率,CLV (Cryoloop vitrification)法(72.00%,7.22％)效果最好,OPS(Open Pulled Straw)法(60.00％,4.85％)次之,straw法(42.22％,0％)最低；(2)CLV法经R-123染色后,卵母细胞线粒体的正常分布率(52.24％)要比其它2组要高(OPS,48.65％；straw,37.68%),但三者之间没有显著差异(P＞0.05)；(3)透射电镜超微结构表明,冻后卵母细胞线粒体变得粗糙和模糊,有的线粒体嵴减少甚至消失.结果表明,冷冻过程中卵母细胞线粒体的分布和形态损伤严重,CLV法可提高冷冻速率,增强冻后卵母细胞的发育能力,降低冷冻造成的卵母细胞线粒体异常分布比例.     

新生死亡克隆猪的组织病理学观察

对1例新生死亡的体细胞克隆猪的5种组织进行详细的组织病理学观察,结果发现:体细胞克隆猪肺脏表现为典型的肺不张,肺泡壁有明显充血;肝脏的肝细胞形态异常,肝索紊乱,无典型肝小叶结构;肾脏的肾小球处于不同发育阶段,肾小管管腔尚未形成,仅有肾小管轮廓。     

体细胞克隆小型猪主要性能指标的测定

通过与普通巴马小型猪的生长发育规律、繁殖性能、生理生化指标和屠宰肉质性能等的比较,了解小型克隆猪的主要性能指标,以期为克隆猪安全性评估及其产业化健康发展提供借鉴.结果表明,体细胞克隆巴马小型猪与普通猪的各项性能指标差异不显著.这种相似性在一定程度上说明了体细胞克隆猪的产业健康性和安全性.     

钙离子及山梨醇对猪卵母细胞孤雌激活的影响

探讨电激液中不同Ca2+浓度与不同电脉冲强度相互关系对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响;以及山梨醇电激活液在猪孤雌激活中的应用。结果表明,当Ca2+浓度不高时,同时增加电激液Ca2+浓度和电脉冲强度能协同促进孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率的提高,Ca2+浓度为0.05和0.1mmol/L时,分别以1.6kV/cm和1.2kV/cm激活,得到的卵裂率为73.75%、74.70%;囊胚率为37.50%、36.83%,显著高于其余各组(P0.05);当Ca2+过高,增加脉冲强度卵母细胞孤雌发育能力反而下降,退化率升高;以山梨醇液进行电激活,在1.6kV/cm时,卵裂率和囊胚率最高,分别为77.23%和34.15%;与甘露醇电激液不同,施加交流电,山梨醇液不能对孤雌胚胎发育起到促进作用;将山梨醇、甘露醇电激液等体积混合,交流脉冲后进行电激活,1.2、1.6kV/cm组卵裂率分别为72.33%和70.03%,囊胚率分别为31.03%和29.60%,虽然略低于甘露醇组(77.07%、36.03%),但优于山梨醇组(69.63%、26.93%),差异不显著(P0.05)。以上结果说明,猪卵母细胞激活所需内流Ca2+浓度存在临界值,临界值内,提高Ca2+浓度或电参数,都能提高卵母细胞的激活效果;超过临界值,效果相反;山梨醇液能够取代甘露醇液用于猪卵细胞的电激活;同时以山梨醇和甘露醇作为电激液的基本成份,完全可以用于猪卵母细胞的电激活或融合。