某海兰褐鸡场祖代、父母代及商品代鸡血管瘤型ALV-J的分离与鉴定

从山东省某海兰褐鸡场祖代、父母代种鸡和商品代蛋鸡中获得疑似血管瘤型禽白血病(Avian leukosis,AL)病料.采用病理剖检、IFA、分子生物学检测,确定为J亚群禽白血病.从祖代、父母代病料中各分离到1株J亚群禽白血病病毒(J subgroup of avian leukosis virus,ALV-J),从商品代蛋鸡中分离到4株ALV-J.根据原型毒株HPRS103设计1对gp85基因引物,获得gp85基因序列.获得的gp85基因序列与各亚群参考毒株序列核苷酸同源性比对,结果显示:分离自商品代蛋鸡的Commercial03株、Commercial04株、Commercial06株和父母代分离株Parent02株位于同一分支,同源性在97.2％～97.9％,与HPRS103株同源性94.7％～95.2％;Commercial05株与祖代分离株Grandparent01株在同一分支,与HPRS103株同源性为98.3％,4株分离自商品代的ALV-J同源性为95.0％～99.9％.表明商品代蛋鸡中的ALV-J可能来自父母代或祖代种鸡的垂直传播,也可能来自于其他来源的水平传播.从同一鸡场祖代、父母代及商品代鸡中分离得到ALV-J,这在我国还是首次.对后续研究其基因突变、致瘤机制等奠定了良好的基础.     

J亚群禽白血病对商品蛋鸡生产性能影响的研究

试验对一个大型蛋用鸡场的不同种源商品代蛋鸡群的J亚群禽白血病毒(ALV-J)感染状态与鸡群总死淘率、肿瘤发生率、生产性能的相关性进行了研究。结果表明,从ALV-J感染的父母代鸡场引进的商品代蛋鸡,从性成熟开始不仅整个鸡群的ALV-J抗体阳性率较高,而且总死淘率显著高于生产标准,主要是由肿瘤/血管瘤引起。这些鸡群的产蛋性能也显著低于生产标准。从2009年下半年起,选择无ALV-J感染的父母代种鸡场作为种源,引进19批约190万只雏鸡,分别在1~21周龄抽检血清ALV-J抗体,均为阴性,且不再有肿瘤/血管瘤发生。两年多来,这些无ALV-J感染蛋鸡群的总死淘率不仅比ALV-J感染鸡群降低8.34%,也显著低于生产手册的规定,产蛋率及产蛋高峰持续期均显著高于生产标准。临床和试验观测表明,种鸡感染ALV-J能显著影响商品代蛋鸡的生产性能,选择无ALV-J感染的种源是规模化养鸡场生物安全的最重要措施之一。     

山东不同品系蛋鸡禽白血病流行病学调查

为了解山东不同品系蛋鸡白血病流行情况,作者采集了山东各地区主要引进品系及地方品种鸡的血清3882份、棉拭子2428份和疑似病例41例,对采集样品分别进行了血清学、病理学及病原学检测.结果表明:包括祖代鸡在内的各品系蛋鸡群P27抗原阳性率为19.36%;ALV-A/B亚型抗体阳性率9.29%、ALV-J亚型抗体阳性率5.18%、REV抗体阳性率13.77%;发病鸡群主要是商品鸡群和父母代鸡群,海兰褐祖代鸡群也有发病;病理学诊断证明肿瘤类型主要为髓细胞瘤(27/41)、血管瘤或血管内皮细胞瘤(7/41)、纤维肉瘤(2/41)、平滑肌肉瘤(2/41)及马立克氏病(5/41);PCR检测结果显示,41份病料中有33份为ALV-J阳性(80.49%);22份为MDV阳性(53.66%);两者共感染率高达43.9%;从疑似病例分离到的17株ALV-J病毒gp85基因的同源性为94.0%～100%,与ALV-J原型株HPRS-103 gp85基因同源性为94.3%～98.7%;与其它已发表的分离毒株ALV-J gp85基因的同源性较低(84.4%～96.8%).调查结果表明,目前山东各品系蛋鸡群均存在ALV感染,其中以ALV-J为主,ALV-A和ALV-B同时存在,且存在与MDV、REV的混合感染,病鸡主要表现髓细胞瘤和血管瘤.     

蛋鸡J亚群白血病临床、病理和病原学研究

为了解白血病发病过程和病变多样性,从一个严重发生过ALV-J诱发肿瘤/血管瘤的240日龄海蓝褐商品代蛋鸡群中挑选28只不能正常产蛋鸡在实验室连续观察50 d.其中7只分别在249～265日龄死亡,1只出现趾部血管瘤,死后剖检6只出现肝、脾肿大,血管瘤或肿瘤结节.其余21只300日龄剖杀,4只趾部血管瘤,剖检后,除4只外均有不同的内脏病变如肝、脾肿大,弥漫性白色肿瘤结节或纤维肉瘤,以及骨硬化等.对21只采血分离病毒,均分离到ALV-J.对7个分离株gp85扩增克隆测序,表明该分离株与J亚群参考株gp85核苷酸序列同源性最高,在86.9％～95.5％,与A-E亚群ALV的同源性50.6％～53.3％.     

2009-2010年山东地区蛋鸡禽白血病病原学和血清学调查

为了解山东地区蛋鸡禽白血病( Avian Leukosis,AL)的流行病学情况,从泰安、临沂、青岛、聊城等4个地区的祖代种鸡场及其具有亲缘关系的父母代、商品代鸡场采集1827份血清,其中祖代鸡血清597份、父母代鸡血清710份、商品代鸡血清520份;并采集1209份泄殖腔棉拭子,其中祖代鸡棉拭子597份、父母代鸡棉拭子460份、商品代鸡棉拭子152份.通过ELISA检测试剂盒进行了血清的ALV-J、ALV-AB抗体检测、泄殖腔棉拭子的P27抗原检测.结果显示:祖代鸡ALV-J抗体、ALV-AB抗体、P27抗原的平均阳性率分别为0、0.84％、17.93％,其中不同地区P27抗原阳性率存在较大差异,泰安、聊城、青岛地区P27抗原阳性率分别为52.5％、0.58％、0;父母代鸡ALV-J抗体、ALV-AB抗体、P27抗原的平均阳性率分别为8.45％、3.10％、30.48％,不同地区之间三者差别较大;而商品代鸡ALV-J抗体、ALV-AB抗体、P27抗原的平均阳性率分别为13.46％、8.65％、18.42％,不同地区之间三者也存在较大的差别.祖代、父母代及商品代间抗体或抗原阳性率高低的明显相关性,提示存在垂直感染的可能性.山东地区祖代种鸡未检测到ALV-J抗体,ALV-AB抗体检出率极低,仅为0.84％,但个别祖代鸡场P27抗原的阳性率极高,可能存在免疫耐受感染;父母代、商品代鸡群抗体阳性率和抗原阳性率均比祖代高,说明它们已有ALV-J、ALV-AB的感染;父母代及商品代鸡群ALV-J抗体水平都高于ALV-AB抗体水平,说明山东省内AL以ALV-J感染为主,应注意研究其传播途径,加强检疫净化.     

禽白血病病毒J亚群自然感染商品蛋鸡致瘤性新特征

2009年8月,山东省邹城市某海兰褐蛋鸡群,160日龄发病,死亡率为7％.患鸡经大体剖检、病理组织学、PCR和免疫组织化学等检测,确诊为禽白血病病毒J亚群(ALV-J)感染.病理组织学检测发现,病鸡单独患血管瘤,或髓细胞瘤和纤维肉瘤多发性出现,由ALV-J自然感染引起同一鸡体出现髓细胞瘤和纤维肉瘤尚属国内外首次报道.肝脏研磨接种DF-1细胞培养7d后传3代,细胞无病变,ELISA检测感染细胞上清ALV p27抗原阳性,进一步确诊此鸡群为ALV感染.对病变严重的鸡进行病毒分离及ALV-J gp85基因同源性比较显示与原型株HPRS-103的同源性最高,达94.1％.本研究丰富了ALV-J感染的临床诊断依据,并为ALV-J在我国蛋鸡群中多潜能致瘤机制的研究提供了科学基础.     

髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒四川株SCGS-1的分离鉴定及前病毒cDNA重组质粒的构建

为分析髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒(ALV-J)地方分离毒株的分子特征及开展该病毒的反向遗传操作研究,本试验从四川某肉种鸡场髓细胞瘤病变病鸡的组织中分离到1株髓细胞瘤型ALV-J,命名为SCGS-1.序列测定表明其前病毒cDNA全序列长7 499 bp,与其他ALV-J代表毒株序列相似性均为95％～99％.在所有基因中,其env基因和LTR序列与其他毒株相应序列同源性相对较低,env基因同源性为93.0％～99.5％,LTR基因同源性为92％～95％,pol基因同源性为97％～99％,gag基因同源性为94％～97％.根据该毒株序列和质粒pUC19的序列,将SCGS-1株前病毒cDNA全序列分3段克隆入pUC19中,构建含SCGS-1前病毒cDNA的重组载体并命名为pUC-SCGS.试验结果为研究ALV-J的进化规律和开展反向遗传操作打下基础.     

地方品系蛋鸡感染J亚群禽白血病病毒的诊断

对临床上发生肿瘤病例的地方品系蛋鸡进行剖检,采集病料与血液样品接种DF-1细胞进行病毒分离、禽白血病病毒(ALV)p27抗原检测、间接免疫荧光试验、PCR鉴定及测序分析。结果显示,该鸡群存在ALV-J的感染,分离到的2株ALV-J,分别命名为JS16LK01和JS16LK02。这两个分离株与ALV-J参考株gp85氨基酸同源性为87.0%~93.6%,与其他亚群ALV同源性在42%以下,两分离株同源性为91.4%,等于或低于与ALV-J原型毒HPRS-103株的同源性,变异较大。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒SD1009分离株的分离鉴定及全基因组序列分析

为分析我国J亚群禽白血病病毒(ALV-J)蛋鸡分离株的进化关系,本研究将山东省某鸡场采集的蛋鸡病料样品接种DF-1细胞系,利用ELISA群特异性抗原检测以及亚群特异性间接免疫荧光方法,分离鉴定得到一株ALV-J,命名为SD1009,并对其进行全基因组测序,将该序列与其他ALV-J代表性病毒株序列进行比较。结果表明:SD1009分离株的gag和pol基因相对保守,与各参考病毒株的同源性为95%～99%,env基因的同源性为91%～95%;在其5'UTR中出现了连续19 bp的插入突变,与TW-3577、SDAU09C3、JS09GY6、JS09GY3蛋鸡分离株的5'UTR基本一致,提示19 bp的插入现象可能是近年来蛋鸡ALV-J的进化趋势;此外,其3'UTR的rTM和DR区出现部分缺失现象,该缺失部分也可能与ALV-J进化相关。     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病的鉴定及其病理学观察

为调查安徽省五华鸡J亚群禽白血病(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)的感染情况,采用ELISA对五华鸡进行P27抗原和ALV-J抗体检测.挑选5只抗原抗体阳性鸡进行PCR检测,同时将5只抗原抗体阳性鸡和5只抗原抗体阴性鸡进行剖检,制作病理切片.其中1只鸡PCR检测为阳性,能扩增出545 bp条带,PCR检测阳性的鸡其心脏有肿瘤、脾脏肿大等病理学变化;组织切片发现心脏、肝脏、脾、肾、肺等组织内有弥漫性髓细胞样瘤细胞或髓细胞瘤病灶,髓细胞样瘤细胞的细胞质内可见嗜酸性颗粒.结果表明五华鸡已经感染了ALV-J,且部分鸡个体已经发病.     

表现腺胃炎的蛋用型鸡J亚群-白血病病毒的分离与鉴定

从表现腺胃炎的尼克珊瑚粉商品代蛋鸡中分离到J亚群-白血病病毒(ALV-J)。将病料或鸡白细胞接种于CEF,培养12 d,分别采用单克隆抗体间接免疫荧光试验检测,结果10只鸡中有9只鸡分离到ALV-J,其中有4只鸡还存在与禽网状内皮增生病病毒(REV)的共感染。通过PCR扩增gp85基因,与已发表的20株ALV-J进行同源性比较。结果表明,与来自白羽肉鸡的HPRS103的同源性为97.8%,而与来自蛋用型鸡的SD07LK1株的同源性为93.0%。本研究发现,在某些仅仅发生腺胃炎的鸡也可能普遍存在ALV-J感染,再次显示了腺胃炎病料中病毒感染的多样性。ALV-J可能成为致腺胃炎的病原之一,但其致病作用有待进一步研究。     

安徽省禽白血病感染的血清学调查及gp85基因的扩增

随机抽取安徽省3个肉种鸡场种鸡及3个地市农贸市场商品鸡的血清样本和泄殖腔拭子,采用ELISA进行鸡白血病检测,并对J亚群鸡白血病病毒抗体阳性鸡群中病鸡的肝组织、全血及上毒细胞提取DNA进行PCR扩增和基因测序。检测结果表明,3个肉种鸡场中J亚群鸡白血病抗体阳性检出率分别为：0、73.50%和15.22%;3个农贸市场商品鸡抗体阳性检出率分别为：12.00%、2.22%和9.10%。3个肉种鸡场A、B亚群鸡白血病的抗体阳性率分别为0、17.93%和1.08%,ALV抗原阳性率分别为2.17%、17.93%和15.22%。PCR检测结果表明,从可疑发病鸡的肝组织和全血中均能扩增出ALV-J gp85特异性片段。结果证实安徽省鸡群中有ALV-J感染,并呈不同程度的流行,应引起高度重视。     

血管瘤禽白血病病毒FJ0610株的分离与鉴定

为了解禽白血病病毒在商品蛋鸡中的流行情况,试验采用病理剖检、聚合酶链式反应(PCR)以及间接免疫荧光试验(IFA)等方法对送检的疑似禽白血病病毒感染的商品蛋鸡进行了病毒分离与鉴定,并对分离株的致瘤相关基因gp85基因进行测序,与国内外各亚群禽白血病病毒进行对比。结果表明:分离、鉴定到1株J亚群血管瘤禽白血病病毒,命名为FJ0610;分离株gp85基因核苷酸序列同源性在11.5%～94.5%之间,其中与血管瘤禽白血病毒株ZH-08株同源性最高,而与E亚群毒株同源性最低;基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明FJ0610株的gp85序列与ZH-08株的亲缘关系最近。     

2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测。结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%)。14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上)。该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在。     

Response of white leghorn chickens of various genetic lines to infection with avian leukosis virus subgroup J

In Experiment 1, chickens from various white leghorn experimental lines were inoculated with strain ADOL-Hcl of subgroup J avian leukosis virus (ALV-J) either as embryos or at 1 day of age. At various ages, chickens were tested for ALV-J induced viremia, antibody, and packed cell volume (PCV). Also, at 4 and 10 wk of age, bursal tissues were examined for avian leukosis virus (ALV)-induced preneoplastic lesions with the methyl green-pyronine (MGP) stain. In Experiment 2, chickens harboring or lacking endogenous virus 21 (EV21) were inoculated with strain ADOL-Hcl of ALV-J at hatch. All embryo-inoculated chickens in Experiment 1 tested positive for ALV-J and lacked antibody throughout the experimental period of 30 wk and were considered viremic tolerant, regardless of line of chickens. By 10 wk of age, the incidence of ALV-J viremia in chickens inoculated with virus at hatch varied from 0 (line 0 chickens) to 97% (line 1515); no influence of ALV-J infection was noted on PCV. Results from microscopic examination of MGP-stained bursal tissues indicate that ALV-J can induce typical ALV-induced transformation in bursal follicles of white leghorn chickens. Lymphoid leukosis and hemangiomas were the most common ALV-J-induced tumors noted in chickens in Experiment 1. At termination of Experiment 2 (31 wk of age), 54% of chickens harboring EV21 were viremic tolerant compared with 5% of chickens lacking EV21 after inoculation with ALV-J at hatch. The data indicate that genetic differences among lines of white leghorn chickens, including the presence or absence of EV21, can influence response of chickens to infection with ALV-J.     

抗J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性

J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种主要感染肉用型鸡的反转录病毒。本研究用表达ALV-J囊膜蛋白基因产物的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞NS1进行融合，获得了4株特异性抗ALV-J的单克隆抗体。免疫荧光分析结果表明，3株单克隆抗体仅与所试验的ALV-J毒株反应，而不能与ALV的A、B、C、D和E亚群的毒株反应。有趣的是，有一株单克隆抗体可以与所有试验的外源性ALV毒株反应，但不与内源性的E亚群反应。Western Blot和免疫沉淀试验结果表明，单克隆抗体识别的ALV-J囊膜糖蛋白的分子量为90-94kD，识别未糖基化的囊膜蛋白分子量约为53kD。用这些单克隆抗体能检测出ALV-J病毒感染鸡胚成纤维细胞中的病毒抗原。这些结果提示这些单克隆抗体可用于ALV-J疾病的诊断和流行病学调查。     

血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒E元件缺失突变体的构建

为构建血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒E元件缺失突变体病毒,本研究利用融合PCR方法将E元件缺失,获得含有缺失性突变体病毒前病毒全基因组的重组质粒pSCAU-HN-△E。将该重组质粒纯化后转染DF-1细胞,并连续传代,最终获得缺失病毒rSCAU-HN-△E。该毒株感染的DF-1细胞可被ALV-J特异性单克隆抗体JE9所识别,并且体外增殖性能稳定。该缺失性病毒的获得为E元件功能的研究奠定了基础。