非珂字棉系统陆地棉的转化效率

本文主要阐述影响棉花转化率的受体因素。结果表明,利用不同的棉花品种进行外源基因转化,品种之间存在着显著的差异,其中冀合713、冀合321、珂字201等的出愈率、分化率均比较高,其转化苗率在3.8%以上,是良好的转化受体材料。利用易于分化再生的棉花品种作受体,是直接获得正常的转基因再生苗、提高转化率的必要条件。农杆菌菌株AGL-1和LBA4404两者对棉花的侵染力没有显著差异。     

种植转基因棉对4种土壤酶活性的影响

 在温室试验条件下,研究了种植转Bt基因棉、转Bt+CpTI基因棉在不同生育期对根际土壤脲酶、多酚氧化酶、蛋白酶和磷酸酶活性的影响。结果表明：从苗期到花铃期,土壤脲酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性表现为先升后降,而蛋白酶和中性磷酸酶活性则表现为先降后升;同一品种在相邻两个生育期土壤脲酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和中性磷酸酶活性的差异达极显著水平（P<0.01）。与亲本常规棉相比,种植转基因棉降低了土壤脲酶活性和土壤酸性磷酸酶活性,对土壤脲酶活性转Bt基因棉和转Bt+CpTI基因棉降幅分别为23.06%和45.36%;对土壤酸性磷酸酶活性转Bt基因棉和转Bt+CpTI基因棉降幅分别为10.89%和34.91%;转Bt+CpTI基因棉sGK321的种植对土壤酶活性的影响较大：对脲酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和中性磷酸酶活性的影响差异均达到了极显著水平（P<0.01）。     

棕色棉茎尖基因枪遗传转化

为了建立高效的棉花茎尖遗传转化体系,以棕色棉品种新彩棉5号为材料,采用茎尖培养和基因枪遗传转化方法,通过对凝固剂种类、活性炭含量、卡那霉素浓度、渗透处理时间、轰击压力、轰击距离等因素的优化,建立了棕色棉新彩棉5号茎尖基因枪遗传转化技术体系。结果表明,不同凝固剂种类、活性炭含量、卡那霉素浓度、渗透处理时间、轰击压力和轰击距离对棕色棉茎尖转化率有明显影响。最佳的遗传转化体系为:前渗处理4 h,轰击压力7.586 MPa(1100 psi),轰击距离9 cm,轰击后恢复培养4 d,然后在MSB+8 g·L~(-1)琼脂+125mg·L~(-1)卡那霉素筛选培养基中筛选25 d。获得抗性芽后,在添加1 g·L~(-1)活性炭的生根培养基中诱导抗性芽生根,并获得抗性再生植株。通过PCR和q PCR检测,5200个茎尖共获得16株阳性转基因植株,转化率为0.31%。该技术体系的建立为棕色棉的遗传转化奠定了基础,为彩色棉育种提供了新的材料。     

转育Bt抗虫基因棉与常规棉种子的活力比较

转育Ｂｔ抗虫基因棉与常规棉种子的活力比较李爱莲，曾献英，陈玉萍，吕双俊（河南省农科院经作所郑州４５０００２）我国目前育成的转育Ｂｔ抗虫基因棉，常表现为出苗差、苗期长势弱、棉铃小等。本文通过对抗虫棉种子的籽指、仁指、脂肪与蛋白质含量，适温与低下种子的吸...     

海岛棉两种转Bt基因方法的研究

 以新疆海岛棉军海1号为受体,利用农杆菌菌液喷雾法（Floral spray）和质粒注射法（Plasmid injection）导入外源Bt基因。经过对转化植株T₁和T₂代大田筛选和PCR、Southern检测,并经孟德尔遗传规律符合度分析,结果表示：农杆菌菌液喷雾法T₀代成铃率比质粒注射法高8.3百分点;两种方法均可获得转基因植株,农杆菌菌液喷雾法较质粒注射法转化率高3.4百分点;农杆菌菌液喷雾处理后代较符合孟德尔遗传规律且单拷贝插入几率高。因此,农杆菌菌液喷雾法优于质粒注射法。     

白菜转脂蛋白-CaMBP10基因RNAi沉默体系的初步建立

为了研究白菜转脂蛋白-CaMBP10的体内功能,构建含有该基因片段的RNAi质粒,以农杆菌介导法对大白菜‘津育60’进行遗传转化,通过对转基因植物在生物与非生物胁迫中表型变化的研究,确定其体内功能。本文报告RNAi质粒的构建、鉴定及其转化植株基因组DNA中外源片段的鉴定。DNA分析结果显示外源基因已成功插入了白菜基因组,RT-PCR检测结果显示转化植株内源CaMBP10基因的表达明显降低,为后续的转脂蛋白体内功能研究奠定了基础。     

土壤胁迫与温度对转Bt基因棉抗虫性的影响

土壤水分过多和过少均不利于转 Bt基因棉杀虫蛋白的表达 ,土壤涝渍可造成转 Bt基因棉抗虫性的显著下降 ,而土壤干旱的影响则相对较小。低温 ( 1 8℃ )不仅可明显降低转 Bt基因棉抗虫基因的表达活性 ,亦可明显降低已表达于棉株中的杀虫蛋白的抗虫活性。高温 ( 3 8℃ )亦可降低转 Bt基因棉抗虫基因的表达活性 ,但较低温的影响则相对较小 ;高温下已表达于棉株中的杀虫蛋白对低龄棉铃虫幼虫的抗虫活性明显增强。因此 ,应加强转 Bt基因棉田的水肥管理 ,保证转 Bt基因棉抗虫性的高效表达 ,重视各种异常天气后转 Bt基因棉田间的虫量监测 ,适时进行防治     

农杆菌介导的棕色棉胚珠离体培养遗传转化体系的建立

本研究以棕色棉品种‘棕1-61’为受体材料,以茁-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)为报告基因,探索农杆菌介导离体培养胚珠的遗传转化条件。结果表明最适合的遗传转化条件是:1 DPA胚珠预培养4 d后,用针头进行扎孔处理形成伤口,在OD600为0.6~0.8的农杆菌菌液中侵染3 min,22℃黑暗条件下共培养20 h后转移至含500 mg/L卡那霉素的BT培养基上进行暗培养。GUS染色结果发现,暗培养20 d的胚珠和30 d的纤维上均有染色,证明GUS报告基因转化成功。进一步将目的基因Gh UFGT构建RNAi载体并进行转基因,荧光定量PCR检测发现转基因阳性胚珠中Gh UFGT基因的表达量与对照相比显著下降。该实验为研究纤维发育和色泽相关基因的功能提供了一种快速高效的遗传转化方法。     

以茎尖分生组织为受体用农杆菌介导法转化激发子基因pemG1棉花植株的获得

为了解决棉花常规遗传育种周期长,农杆菌介导的转化下胚轴再生难,转化率低,胚变异率高等难题。通过改善茎尖的遗传转化,利用农杆菌介导法转化棉花茎尖,试图缩短转化周期,获得转化苗。构建了稻瘟菌激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-pemG1,分别以‘珂字312’、‘中棉24’棉花茎尖分生组织作为外植体,摸索无菌苗的最佳培养方案,确定最佳共培养温度、共培养时间及卡那霉素筛选浓度。经过共培养,茎尖在诱导芽培养基上诱导生芽,从不同浓度的BAP和NAA生长激素的组合中,最终确定0.1 mg/L的BAP和NAA最适合芽的诱导;经过两个月的继代培养,在含有GA3的茎增殖培养基上完成茎的增殖和延伸;切取幼芽并使其在含有0.1 mg/L的IBA生根培养基中生根;生根的抗性植株移栽到温室中成苗,获得了T0代转基因株系4株。进行了转pemG1阳性植株的初步验证。     

陆地棉品种百棉1号主要株型性状的遗传研究

对陆地棉品种百棉1号主要株型性状进行了主基因-多基因混合遗传分析。结果表明,株高、果枝长度、株高/果枝长度、主茎节间长度、果枝节间长度、总果节数、总果枝数、有效果枝数和果枝夹角的最适模型分别为D-4、C-0、D-4、D-2、E-0、D-2、B-1、B-1和C-0,除果枝长度和果枝夹角外,其它性状均检测到主基因。总果枝数、有效果枝数和果枝节间长度为主基因遗传或以主基因遗传为主,对其可采用单交重组或简单回交转育转移增效主基因;株高、株高/果枝长度、主茎节间长度、果枝长度和果枝夹角为多基因遗传或以多基因遗传为主,对其可采用聚合回交或轮回选择累积增效多基因;总果节数以主基因和多基因遗传并重,对其可根据主基因、多基因相对效应大小分别考虑。     

转抗旱基因棉对土壤酶活性及速效养分含量的影响

旨在探究不同生育期内种植转抗旱基因棉及其常规棉对土壤酶活性及速效养分含量的影响。应用化学分析法和溶剂浸提法对2种棉花的土壤酶活性和速效养分含量进行比较分析。结果表明,在苗期,转抗旱基因棉土壤速效磷含量显著低于其常规棉,而土壤铵态氮、硝态氮含量和脲酶活性则显著高于其常规棉,其余4个生育期它们的含量与活性均无显著差异,土壤碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性5个生育期差异均不显著。对土壤酶活性和土壤速效养分含量的相关性分析表明,土壤铵态氮含量与土壤脲酶活性呈显著正相关,而与土壤碱性磷酸酶活性呈显著负相关;土壤速效磷与土壤全氮呈极显著负相关;土壤硝态氮含量与土壤碱性磷酸酶活性呈显著负相关,与土壤铵态氮含量显著正相关。综上,转抗旱基因棉花的种植几乎并不影响土壤速效养分含量及土壤酶活性,但随着生育期的不同其土壤速效养分含量及土壤酶活性也不同。     

棉花胚性愈伤组织的转化及转基因胚状体的有效萌发与成苗技术研究

以棉花胚性愈伤组织作受体,用农杆菌介导法(农杆菌菌株为A1)将质粒载体pSG529上的异戊烯基转移酶（ipt）基因导入4个陆地棉品种,研究了不同基因型的遗传转化效率并建立了转基因再生植株的有效成苗技术体系。结果表明,在相同的转化条件下,不同基因型的转化效率差异较大,豫早1号和珂字201的遗传转化效率及植株再生能力显著高于豫棉4号和鄂棉23。降低培养基无机盐浓度,用Phytagel固化,能够提高胚萌发成苗率,降低畸形苗频率,在生根培养中添加少量活性碳提高了根系活力。再生植株长到3~5片真叶时,可以切除发褐根系,转移到新鲜的低盐培养基中,重新生根。在试管苗移栽过程中,采用逐步揭开封口膜,炼苗的措施,可以提高试管苗的环境适应能力,显著提高移栽成活效率。     

农杆菌介导McCHIT1基因遗传转化水稻茎尖研究

为了提高农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化效率,笔者以贵州特有的地方水稻品种‘平塘黑糯’茎尖为材料,以含有Ubiqutin启动子驱动苦瓜几丁质酶基因McCHIT1表达的植物表达载体p Cambia-UbiMcCHIT1为转化载体,采用正交试验设计,系统研究了菌液OD600值、真空处理时间和真空渗透压强对水稻茎尖遗传转化效率的影响。结果表明:在3个因素中,真空处理时间是影响水稻转化效率和死亡率的最关键因素。农杆菌介导‘平塘黑糯’茎尖遗传转化的最优条件为农杆菌菌液浓度OD600为1.0、真空处理时间为7 min、真空渗透压强为15 k Pa。GUS组织化学染色和PCR分子鉴定表明,通过本研究优化的农杆菌介导水稻茎尖遗传转化体系,已将苦瓜的几丁质酶基因McCHIT1已整合到水稻基因组中,获得转McCHIT1基因‘平塘黑糯’新种质。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

农杆菌介导贵州平塘黑糯茎尖转化获得转McCHIT1基因水稻研究

为了提高农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化效率,笔者以贵州特有的地方水稻品种‘平塘黑糯’茎尖为材料,以含有Ubiqutin 启动子驱动苦瓜几丁质酶基因McCHIT1 表达的植物表达载体pCambia-Ubi-McCHIT1 为转化载体,采用正交试验设计,系统研究了菌液OD600值、真空处理时间和真空渗透压强对水稻茎尖遗传转化效率的影响。结果表明：在3 个因素中,真空处理时间是影响水稻转化效率和死亡率的最关键因素。农杆菌介导‘平塘黑糯’茎尖遗传转化的最优条件为农杆菌菌液浓度OD600为1.0、真空处理时间为7 min、真空渗透压强为15 kPa。GUS组织化学染色和PCR分子鉴定表明,通过本研究优化的农杆菌介导水稻茎尖遗传转化体系,已将苦瓜的几丁质酶基因McCHIT1 已整合到水稻基因组中,获得转McCHIT1基因‘平塘黑糯’新种质。     

GbTCP10基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

TCP转录因子广泛参与植物细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP10基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP10基因pGEM-T Easy-GbTCP10质粒为模板进行PCR扩增,连接至植物表达载体pCAMBIA3301中,再利用冻融法和热激法转到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得海岛棉GbTCP10基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP10前体的植物表达载体amiRTCP10-pCAMBIA3301,本试验结果有助于进一步研究海岛棉GbTCP10基因的生物学功能和棉花纤维发育机制。     

我国专用棉新品种选育技术体系的建立与应用成效

本项研究在广泛收集和评价长绒、低酚、耐旱碱和抗虫４种专用棉种质资源的基础上，采用全程逆境鉴定和定向选择技术，提高了对逆境抗性的选择效果，混交混选和分裂交配技术的应用，减弱和打破了专用性状与产量及主要农艺性状的遗传负相关，初步建立和完善了抗逆性鉴定技术和指标，生物技术与常规育种技术相结合培育转Ｂｔ基因抗虫棉，实现了我国棉花育种技术的新突破。利用上述技术体系“八五”期间育成各类专用棉新品种１７个，其中抗虫棉和耐旱碱棉新品种为我国首次育成。     

利用根箱法解析转双价（Bt + CpTI）基因棉花对土壤微生物数量及细菌多样性的影响

 利用根箱法对棉花根部土壤进行分区采集,并采用传统平板培养和DGGE克隆测序技术相结合的方法,对转双价基因棉和常规棉3个生长时期(播种后40 d、50 d和60 d)不同根区土壤细菌、放线菌和真菌数量及细菌多样性进行对比分析。平板培养结果表明,与常规棉相比,转双价基因棉S1根区土壤细菌、放线菌的数量显著降低,而S2根区土壤细菌、放线菌、真菌和S3根区土壤细菌、真菌的数量显著增加(P＜0.05);DGGE图谱分析表明,在棉花生长的3个时期内,转双价基因棉和常规棉根区土壤细菌多样性指数、均匀度和条带数均无显著差异(P＞0.05),2种棉花处理间有着很强的相似性,不受转双价基因棉种植的影响。转双价基因棉种植仅改变了根区土壤可培养微生物数量,对细菌多样性无显著影响。     

肥料配施方式对棉花根际土壤酶活性和养分含量的影响

 在田间试验条件下,以转双价(Bt+CpTI)基因抗虫棉sGK321及其亲本常规棉石远321为研究对象,设置了6个不同的施肥处理,比较分析转双价(Bt+CpTI)基因抗虫棉和非转基因亲本棉根际土壤酶活性（脲酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶）及速效养分(硝态氮、铵态氮和速效磷)的变化,探讨不同施肥处理对转双价(Bt+CpTI)基因抗虫棉根际土壤酶活性及养分含量的影响。结果表明,在棉花种植120 d时,与亲本常规棉相比,转双价(Bt+CpTI)基因抗虫棉根际土壤酶（脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶）活性在100%有机肥试验条件下均显著高于亲本常规棉。而在土壤硝态氮含量上,转双价(Bt+CpTI)基因抗虫棉与亲本常规棉之间的差异随着有机肥配施量的增加而减小;除了对照和50%的有机肥、50%的尿素试验条件外,其他处理转双价（Bt+CpTI）基因抗虫棉与亲本常规棉相比,根际土壤铵态氮含量无显著差异。     

中国水仙NtFT2正义基因表达载体的构建与愈伤组织遗传转化体系的建立

构建中国水仙Nt FT2正义基因表达载体,为进一步研究Nt FT2基因对中国水仙芽休眠调控作用提供参考;建立中国水仙愈伤组织遗传转化体系,为中国水仙愈伤组织遗传转化提供技术平台。笔者以中国水仙主芽为材料,通过PCR扩增获得Nt FT2基因;通过PCR、双酶切、连接等方法将Nt FT2基因正向插入到p CAMBIA1301双GUS植物表达载体构建Nt FT2正义基因表达载体P1301-FT2,再通过冻融法将重组质粒P1301-FT2导入根癌农杆菌。采用根癌农杆菌介导法将Nt FT2正义基因转化中国水仙愈伤组织,采用GUS组织化学染色法检测中国水仙愈伤组织遗传转化效率。结果表明,试验成功构建了中国水仙Nt FT2正义基因表达载体P1301-Nt FT2;中国水仙愈伤组织与0.5 mol/L甘露醇共培养6 h后,置于1.0 OD600的农杆菌重悬液中侵染20 min,在25℃、黑暗条件下,共培养6天,其GUS瞬时表达率达到64.28%。构建了中国水仙Nt FT2正义基因表达载体,建立了高效的中国水仙愈伤组织遗传转化体系。