磷矿粉、骨炭和油菜秸秆对重金属复合污染土壤细菌和古菌数量的影响

微生物的活动在土壤生态系统中发挥着重要的作用,作为检测土壤质量的敏感指标,其基因拷贝数的变化是响应外界环境的一种方式.通过土壤盆栽试验,结合Real-time PCR技术研究不同改良剂添加对重金属复合污染土壤细菌和古菌16S rRNA基因拷贝数的影响.结果表明:各处理中土壤细菌16S rRNA基因拷贝数在每克干土6.02×109～1.82×10m个之间,古菌在每克干土7.99×106～2.97×107个之间.污染土壤中添加不同改良剂对土壤中古菌和细菌16S rRNA基因拷贝数的影响有差异,种植玉米与否也影响这两种微生物在土壤的基因拷贝数.不种植玉米时,与对照相比,添加磷矿粉、骨炭和油菜秸秆处理导致土壤细菌基因拷贝数提高116.8％～163.2％;磷矿粉和骨炭处理导致土壤古菌基因拷贝数分别提高171.1％和224.8％.种植玉米时,添加骨炭和油菜秸秆处理导致土壤细菌的基因拷贝数分别比对照处理提高104.2％和92.0％;土壤中古菌的基因拷贝数除了添加骨炭处理显著比对照处理提高231.3％外,其他处理对土壤古菌基因拷贝数均没有影响.     

一株石油烃降解菌TY22烷烃羟化酶基因的克隆及功能研究

[目的]对一株石油烃降解菌TY22的烷烃羟化酶基因alkB克隆测序,并对其外源表达和功能进行研究。[方法]PCR扩增获得alkB基因部分序列,再根据该序列通过染色体步移技术,最终获得完整CDS序列。将alkB基因与pET21b(+)载体构建重组质粒,并转入E.coli BL21(DE3)进行表达。再将alkB基因克隆至pCom8载体中,分别转入E.coli GEc137(p GEc47△B)和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1进行基因功能的互补试验。[结果]染色体步移获得了1 236 bp的烷烃羟化酶基因完整CDS序列(Gen Bank Accession:KU867870)。诱导表达发现,重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳,得到与预期相符的46 kDa蛋白。基因功能互补试验发现,重组菌能在以C12~C16为唯一碳源的培养基中生长。[结论]TY22菌株的烷烃羟化酶基因完整CDS序列全长1 236 bp,能氧化C12~C16的中长链烷烃,并能在大肠杆菌中有效表达。     

环状糊精葡萄糖基转移酶工业生产中发酵染菌（Arthrobacter sp.AMP-5）的分离及16srDNA分析

目的:解决环糊精生产厂家β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glucose-transferase,β-CGTase)发酵生产过程中频繁出现的不明原因的酶活降低问题。方法:采用酚酞筛选培养基从发酵异常的发酵液中分离得到一株杂菌H02S。对H02S进行16srDNA基因序列分析,研究其发酵过程中光密度、pH值、酶活等指标。结果:H02S可在筛选培养基上生长,但不生产β-CGTase,16srDNA基因序列分析可知该菌为节杆菌Arthrobacter sp.AMP-5。该菌优先于生产菌发酵,迅速形成优势菌群并降低发酵液pH值,抑制生产菌增殖。结论:发酵前应预先采用16srDNA基因序列分析鉴定生产菌种,排除污染菌种;操作员也应严格执行空消和实消操作,定期清洁空气过滤系统,防止染菌发生。     

一株高效柴油降解菌Serratia sp. J-3的筛选、鉴定和降解特性

[目的]本文旨在筛选出不同种类和特性的高效降解柴油菌株,研究降解菌株对不同环境下柴油污染的降解机制。[方法]从南京扬子石化厂区的油泥沉积物中分离出1株高效柴油降解菌J-3,通过细菌形态学、生理生化及16S rRNA基因序列分析比对初步鉴定菌株J-3为沙雷氏菌属(Serratia sp.)。通过水培及土壤培养并结合气质联用(GC-MS)和全基因组比对技术研究其降解率和降解机制。[结果]该菌能利用柴油为唯一碳源生长,产生表面活性物质,具有稳定的乳化性能。在温度20～40℃、初始pH5～9条件下生长良好,能耐受15 g·L~(-1) NaCl和5 g·L~(-1)柴油。在最适生长条件(pH7,25℃,1 g·L~(-1) NaCl,0.5 g·L~(-1)柴油)下对柴油降解率为62.0%,GC-MS图谱分析确定菌株J-3对柴油中各组分均有降解能力,对部分中长直链烷烃降解率超过99%。通过菌株J-3的全基因组比对分析,发现2个烷烃氧化相关的基因,烷烃羟化酶基因alkB和长链烷烃羟化酶基因almA,推断菌株J-3能降解柴油可能是这2个氧化酶基因产生作用。将菌株J-3应用于柴油污染土壤修复试验,对土壤中各柴油组分均有降解能力。不同处理下菌株J-3降解率可达33.8%～49.0%,可有效降解土壤中的柴油。[结论]Serratia sp. J-3是一株高效降解柴油的菌株,在水体和土壤中均能很好利用柴油进行生长代谢,可应用于柴油污染实际生物修复工程。     

硫红霉素菌渣有机肥对大豆土壤中耐药菌及相关抗性基因的影响

【目的】研究硫红霉素菌渣有机肥施用后对大豆农田土壤中耐药菌及相关抗性基因丰度的影响，为硫红霉素菌渣有机肥施用生物安全性评价提供科学依据。【方法】检测不同菌渣有机肥施用量下，大豆不同生长时期土壤中耐药细菌的数量和种类，并采用荧光定量PCR方法检测相关抗性基因(ARGs)污染水平，分析菌渣有机肥施用对耐药菌及相关抗性基因的影响。【结果】大豆苗期土壤中各类细菌数量大于结果期，苗期样品中土壤细菌总数、硫红霉素抗性菌数显著高于对照组，而青霉素、头孢拉定抗性菌株数与对照组差异不显著。在结果期样品中，施加了硫红霉素药渣有机肥的土壤中各类菌落总数与对照组差异不显著。所获得14株硫红霉素耐药菌菌株分布于11个菌属，其中假节杆菌属、芽胞杆菌属、类谷氨酸杆菌属菌株数占总菌株数的比例最高，25株青霉素耐药菌菌株分布于7个菌属，其中链霉菌属菌株数最高。12株头孢拉定耐药菌分布于5个菌属，其中假单胞菌属菌株数占比例达到50.00%。施用硫红霉素菌渣有机肥对土壤中常见ARGs的绝对丰度和相对丰度有一定的影响，但影响不显著。【结论】硫红霉素菌渣有机肥施用后对作物土壤中ARGs水平没有显著影响。     

铜绿假单胞菌M2联合小白菜对Pb污染土壤的生物修复

从Pb污染矿区筛选到1株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (M2),采用盆栽试验研究其对Pb污染土壤中小白菜生长、Pb吸收和根际微生物的影响.结果表明:接种M2菌后小白菜生物量提高20.9 ％～31.3％,地上部Pb含量提高15.0 ％～25.4％,根部Pb含量提高15.6 ％～36.8％;对可培养微生物数量的测定表明,在同样的Pb污染浓度下,接种铜绿假单胞菌的土壤中细菌和真菌数量明显提高,细菌提高17.8 ％～29.6％,真菌提高7.2 ％～15.4％,而放线菌提高不明显;细菌16S rDNA的变性梯度凝胶电泳分析表明,接种铜绿假单胞菌的土壤细菌种类比对照土壤多50.0 ％～60.0％.结果证明,接种铜绿假单胞菌能够促进小白菜生长,维持土壤细菌多样性,对土壤Pb污染的植物修复有明显的促进作用.     

一株牛源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定与耐药基因型检测

从病死犊牛肺脏组织中分离到一株革兰阴性短杆菌,进行了细菌分离纯化、生化试验、16SrDNA测序鉴定、小鼠致病性试验、药敏试验,及碳青霉烯类酶与产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)等7种耐药基因的PCR检测。结果鉴定该菌为肺炎克雷伯氏菌,其16S rDNA扩增序列与GenBank中肺炎克雷伯氏菌同源性达99%。对小鼠致病性强。该菌分离株对氨苄西林、头孢呋辛、复方新诺明、红霉素耐药,而对碳青霉烯类、第四代头孢等受试药物均为敏感。耐药基因PCR检测仅扩增出约862 bp的SHV基因片段,与公布的SHV-1基因序列同源性达99.3%。该牛源克雷伯氏菌分离株耐药表型与耐药基因检测结果一致。     

1株牛源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

从一头猝死牛的脾脏内分离得到1株细菌,对该菌染色镜检可见其为革兰氏阳性杆菌,呈单个或链状排列。该菌对头孢氨苄、庆大霉素、诺氟沙星等药物敏感。生化检测结果和16S rDNA序列分析表明,该菌株为蜡样芽孢杆菌;经PCR检测该菌含有hbl、nhe、entFM等毒素基因以及看家基因groEL。动物致病性试验结果显示,该菌具有较强的致病性。上述结果表明,该分离菌为致病性蜡样芽孢杆菌。     

一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析

[目的]对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础.[方法]对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLΠ-4)进行培养,提取其基因组DNA.设计16S rDNA通用引物,扩增16S rDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序.[结果]提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16S rDNA基因片段,长度为1528 bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16S rDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌.[结论]初步将高产脂肪酶细菌JTΠ-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌.     

产表面活性剂菌株的筛选及其功能基因的初步定位

通过以液体石蜡为惟一碳源和能源的选择性富集培养,从某具有有机磷生产史的农药厂内的污染泥土中分离到1株产表面活性剂的细菌,采用形态学、生理生化和16S rDNA基因序列比对分析,对其进行了研究.结果表明,该菌株属于不动杆菌属,暂定名为Acinetobacter sp.W2.通过细菌质粒消除法和细菌质粒的快速检测法实验,初步认定,该菌质粒上含有影响其产表面活性剂的功能基因.     

机油降解菌的分离及其降解特性研究

[目的]分离主要的机油降解菌,并研究其降解特性。[方法]从茂名炼油厂附近长期被石油污染的土壤中,分离机油降解菌株,并对其进行形态特征和生理生化特性的分析。同时进一步研究了该菌株对机油降解特性及影响因素。[结果]分离得到3株机油降解菌,其中1株初步鉴定为芽孢杆菌属。该菌株在温度为40℃、pH值为8．0、机油浓度为100mg／L、N源为NH4Cl的条件下生长旺盛,降解率达到47．2％。[结论]利用生物降解的方法可以更有效地治理石油污染。     

延长油田增油细菌的筛选及其降解特性研究

【目的】分离筛选可提高原油采收率的增油细菌。【方法】以原油为唯一碳源,利用富集培养和稀释平板法从延长油田油污土壤中分离增油菌株;通过排油能力测定、原油附着与乳化性能观察、代谢产物表面活性物质分析及原油降解试验,从分离的菌株中筛选增油性能较好的细菌菌株,并通过菌落形态观察、生理生化特性测定及16S rDNA全序列分析,对筛选的排油及乳化性能较好的细菌进行鉴定。【结果】①从原油及油污土壤中筛选出25株细菌,从中选择10株代谢产物中含有表面活性成分脂肽或糖脂的优势细菌用于后续试验,该10株菌均可导致原油物理化学性质发生变化,提高原油在油水发酵液中的乳化度,同时降低原油对瓶壁的附着度。②4株乳化及排油效果较好的菌株6-1、P₁H₁₃₂、AP₁H₁₁和6-3Y对原油的降解效果较好,与原油作用后,原油组分中有34.0%～55.3%的组分被细菌完全降解而消失。③4株细菌的鉴定结果为：6-1为Rhizobium pusense,P₁H₁₃₂为Zhihengliuella aestuarii,AP₁H₁₁为Bacillus licheniformis,6-3Y为B.aryabhattai。【结论】获得的10株增油细菌具有良好的增油潜力,其中已鉴定的4株细菌可用于进一步的增油试验,在微生物采油和原油污染处理方面具有应用潜力。     

玉米根际溶磷细菌的分离、筛选及溶磷能力研究

采用传统的微生物分离培养法,对玉米根际溶磷细菌进行分离,筛选出38株解无机磷菌株和35株解有机磷菌株,并发现无论是细菌总数,还是溶磷细菌总数,根际土壤都比非根际土壤要多.对筛选获得的73株菌株进行菌落形态观察发现,大多数菌落呈乳白色或黄色、形状不规则或近圆形、光滑黏稠、扁平、不透明、边缘不整齐.进一步利用钼锑抗比色法测定其溶磷能力,发现无机磷菌株溶解的有效磷含量与培养液pH之间存在显著的相关性,有机磷菌株则无明显相关.各菌株溶解磷酸钙和卵磷脂的能力差异较大.无机磷菌株和有机磷菌株对无机磷(磷酸钙)和有机磷(卵磷脂)的溶磷量分别为8.88～108.31和0.51～3.53 mg/L.菌株中SWJ1-4和SWJ3-1溶解无机磷能力较强,RYJ1-6溶解有机磷能力较强,且这3株菌株生长快、生长状况良好,在后续微生物菌肥研制中具有较大潜力.     

向日葵菌核病生防细菌的初步筛选

从供试的土壤中分离得到50个细菌分离物。经平板抑菌实验,筛选出10个对菌核菌(Selerotiniascleroti orum)有明显的拮抗作用的菌株。进一步对峙培养,拮抗细菌对菌核菌的拮抗效果最佳的为A03和DE,测其抑菌带宽度分别为6.3mm、12.1mm。     

盐渍化土壤中土著菌的石油烃降解潜力研究

自盐渍化地区(黄河三角洲)采集4种不同石油污染程度的土壤样品,从中筛选出高效降解石油烃的4个菌系和8个单菌株.分别以原油、柴油、烷烃和多环芳烃(PAHs)为底物进行培养,测定降解菌的生物量和降解率,研究其对不同底物的耐受浓度和降解潜力.结果表明,获得的石油烃降解菌为轻度嗜盐菌;不同菌株对不同底物的耐受浓度不同,混合菌系对不同底物的降解能力强于单菌株,对单一组分底物的降解优于复杂组分的底物;单菌株1-2、3、5、7能较好地降解PAHs并且对原油的降解能力高于柴油,单菌株1-1、4、6、8能够利用烷烃且对柴油的降解能力要比原油高;降解菌对柴油和原油的最高降解率分别可达78.4%和70.7%,对正十六烷和菲的生物降解率分别高达87.7%和88.1%,表现出较强的降解能力.研究结果表明黄河三角洲盐渍化土壤中土著菌对石油烃污染土壤具有较强的生物修复潜力.     

鳗鲡肠道中嗜水气单胞菌的拮抗菌筛选

从鳗鲡肠道中分离到643株细菌,用点种法筛选出65株病原性嗜水气单胞菌的拮抗菌,研究拮抗效果最好的14株拮抗菌的抗菌谱、生长曲线以及与病原性嗜水气单胞菌的共凝集作用.研究结果显示：NAC琼脂培养基筛选的2株拮抗菌（Na3-38和Nb3-15）对7株指示菌均有较强的拮抗作用,Aa3-22和Mb3-7对7株指示菌中的5株有拮抗效果;除Na3-38和Nb3-15以外,其余12株的生长系数均大于嗜水气单胞菌;11株拮抗菌（Na3-38、Nb3-15、Ab2-55、Ab2-77、Ab1-3、Aa3-22、Aa3-67、Mb1-4、Mb2-10、Mb3-7和Mb3-27）和嗜水气单胞菌的共凝集率大于10%.这表明：Aa3-22和Mb3-7在抗菌谱、生长曲线以及与病原性嗜水气单胞菌的共凝集作用都适合作为益生菌.     

农业耕地土壤中114株农药降解菌的分离与筛选

根据农田使用农药史选择灭蝇胺、氯氰菊酯、异丙威进行农药富集培养和平板划线分离,在28种长期受农药污染的不同作物耕地土壤中分离到114株农药降解菌,并用高效液相色谱法测试对吡虫啉(100μg/ml)的降解率,72 h后进行检测。结果 114株降解菌中用吡虫啉筛选到10株降解率达到25%以上的细菌,降解率为10%～25%之间的细菌为78株,降解率小于10%的细菌为26株。对农药降解效果较好的降解菌主要分布在长期大量使用农药的蔬菜作物(大姜、大葱、芦笋等)耕地土壤,而施药相对较少的果园和棉花田中降解菌的数目和降解能力偏低。     

耐盐植物虎尾草内生解烃细菌的筛选及其降解特性

从耐盐植物中分离具有石油烃降解功能内生细菌并研究其降解特性,为内生细菌协同宿主植物修复石油污染盐渍化土壤提供基础。以黄河三角洲长期受石油污染重盐碱地生长的耐盐植物虎尾草为材料,分离出能以柴油为唯一碳源生长的内生细菌24株。通过柴油降解试验,筛选得到1株高效石油烃降解内生细菌BF04。经生理生化特性及16S r DNA同源序列分析,确定BF04为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。通过液体培养试验研究了BF04对不同烃的利用能力和对柴油的降解动力学特征。结果表明:BF04能够利用直链烷烃、支链烷烃和单环芳烃,不能利用多环芳烃和苯酚。BF04能降解柴油中大部分烷烃,其中对短链烷烃(n C11~n C23)降解率高于长链烷烃(n C24~n C27)。BF04对柴油降解可以用一级反应动力学模型表示。在含有3%Na Cl的液体培养基中,BF04具有较强的降解柴油能力,在修复石油污染高盐环境中具有一定的应用潜力。     

一株沿海滩涂细菌的降油及生长特性研究

采用以原油为唯一碳源的基础培养基,从原油污染的沿海滩涂土壤中分离筛选具有降油性能的细菌;采用柴油培养基测定分离菌株对柴油的原始降解率;通过在柴油培养基中添加不同浓度的葡萄糖(0、1、2、4、8、16 g/L),及不同浓度的酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵(以氮计,浓度为0.5、1、2 g/L)和磷酸二氢钠(0、4、8、12 g/L)后,测定分离菌株的降油性能;鉴定分离菌株并研究其生长特性.结果表明:共分离到5株能以原油为唯一碳源生长的细菌,其中1株原始降油率最高(19.0％),编号为Y-3;在添加1 g/L以上葡萄糖时,Y-3菌株降油率升高,添加4 g/L葡萄糖时达最高(79.9％);酵母膏和蛋白胨可提高Y-3菌株的降油率,尿素、硫酸铵和磷酸盐对降油率影响不明显;根据形态学、生理生化鉴定以及16S rDNA序列分析,确定Y-3菌株为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida,Y-3菌株的最适生长温度为30℃,最适生长pH为8,适宜生长NaCl浓度为0～30 g/L.     

松苗猝倒病不同病原物的致病性差异及其生防细菌的筛选

从3个湿地松苗圃土壤中分离出了66株松苗猝倒病的致病真菌,63个菌株为镰孢属真菌,2个为链格孢菌,1个为丝核菌属真菌。对66个真菌菌株进行松苗猝倒病的致病性测定表明:12个真菌菌株为无致病性或弱致病性真菌,17个镰孢属菌株为强致病性真菌,其余37个为中等程度致病性真菌。从湿地松幼苗根系分离到了细菌菌株320株,平皿拮抗测定表明其中的10个菌株对松苗猝倒病病原真菌有强拮抗作用,对松苗猝倒病有较大的生防潜力。16SrDNA序列分析表明这10个生防菌株的分类地位分别是:7株为洋葱伯克霍尔德菌,2株为枯草芽孢杆菌,1株为待定种。