福建马铃薯S病毒的分子鉴定及发生情况

为明确福建省马铃薯S病毒(PVS)的发生与分布情况,对福建省马铃薯主要种植区的PVS进行了鉴定和普查.在利用电镜技术和传统生物学方法鉴定的基础上,克隆了PVS外壳蛋白(cp)基因,依据PVS外壳蛋白氨基酸序列建立了PVS不同分离物的系统进化树.研究表明,利用PVS 外壳蛋白氨基酸序列分析可准确鉴定PVS,同时可分析不同分离物间的分子差异.利用病毒特异性引物和DIG标记的PVS cp基因为探针,分别利用RT-PCR技术和核酸斑点杂交技术(NASH)对PVS进行了检测,并对检测技术进行了改进.调查结果表明,PVS在福建省广泛分布,发病率最高可达80%以上,当地农家自留种可能是田间PVS的主要来源.     

小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的成员,是危害我国小麦生产的一种重要病毒病害.RNA干扰是由dsRNA介导的,通过核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的一种基因沉默现象,这种调控机制在植物抗病毒基因工程育种中已得到广泛应用.以RNA干扰为原理、以病毒的外壳蛋白基因为靶标,构建了抗WYMV的植物表达载体.采用基因枪方法共转化‘扬麦12’的幼胚愈伤组织,得到了再生植株.对To代进行PCR检测,得到15株阳性植株.     

甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

 根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3'端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

马铃薯A病毒CP基因的克隆与序列分析

利用根据马铃薯A病毒 (PVA)外壳蛋白 (CP)基因序列设计合成的一对引物 ,以带毒植物总RNA为模板 ,RT-PCR扩增得到长 0.8kb的目的片段。将目的片段转入大肠杆菌并进行了序列测定。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较 ,发现其核苷酸同源性最高可达 99%。依据CP序列建立了PVA病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性做了分析     

大麦黄矮病毒GPV株系外壳蛋白基因在E.coli中的表达及抗血清制备

 病毒外壳蛋白基因经适当引物逆转录成cDNA后,应用聚合酶链反应(PCR)扩增,得到大麦黄矮病毒(BYDV)GPV株系的外壳蛋白(CP)基因。将此基因克隆至表达载体pMal,转化E.coli TB1,诱导表达了携带外壳蛋白的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的7%,此融合蛋白的分子量约为60kD,经亲和层析纯化后免疫家兔,获得BYDV-GPVCP的抗血清。     

雀麦花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备

正雀麦花叶病毒(brome mosaic virus,BMV)为正义单链RNA病毒。BMV寄主范围广泛,在波兰等地均有发现(Trzmiel et al.,2015),大多危害禾本科、豆科、茄科等植物,感病植株常表现出褪绿、轻微花叶症状。因此,为减轻BMV造成的经济损失和丰富BMV的检测方式,本研究拟构建BMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因的原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中表达BMV的外壳蛋白,制备高特异性和高灵敏度的抗血清,以期用于BMV的有     

兰花5种病毒可视化基因芯片检测方法建立

为建立运用可视基因芯片技术快速、准确检测兰花病毒的方法,选择黄瓜花叶病毒、齿舌兰环斑病毒、建兰花叶病毒编码外壳蛋白(coat protein,CP)基因、辣椒褪绿病毒编码核衣壳蛋白N基因、落葵皱纹花叶病毒编码CI蛋白基因为目标基因,设计引物和探针(5'标记一段poly T)。利用多重RT-PCR方法进行病毒核酸扩增,将扩增产物与固定于芯片的特异性探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的检测条件下,本研究筛选出2组多重引物组合Cm(F2-R2a)、Ba(F1-R1);Or(F1-R1)、Cy(F2-R2)和Ca(F1-R1),5条特异性探针。所建立的可视基因芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出病毒阳性质粒的量为不低于10~3拷贝·μL~(-1)。     

番茄褐色皱果病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)外壳蛋白(coat protein,CP)的保守基因序列设计l对特异性引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒...     

百合斑驳病毒CP与Cl基因的融合表达、多抗制备及其应用

采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,Cl)基因的3'端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上.构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CL200.重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-C1200.经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体.Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应.用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%.研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础.