平榛ChWRKY2转录因子的克隆及在低温胁迫下的表达分析

根据平榛花芽转录本高通量测序的结果,采用RACE-PCR技术克隆到一个全长675 bp,编码179个氨基酸的平榛WRKY基因,命名为ChWRKY2。ChWRKY2蛋白序列中只含有一个WRKY结构域,锌指结构为C-X4-C-X23-H-X1-H,属于WRKY家族第Ⅱ类成员。对ChWRKY2基因进行实时荧光定量PCR表达分析,结果表明:平榛雌花芽中ChWRKY2在12月份的表达量最高,随后表达量逐渐下降。4℃低温胁迫处理根蘖苗4 h后,叶片中ChWRKY2的表达量快速升高,并在8 h达到最大表达量。此外,ChWRKY2在不同器官中的表达具有差异性,雄花序中表达量最高,其次是雌花芽,树皮(韧皮部)中表达量最低。     

荔波连蕊茶GA2ox1基因的克隆及表达分析

[目的]GA2氧化酶是赤霉素生物合成代谢过程中关键酶之一,GA2ox家族基因常被用于植物矮化基因工程育种。[方法]根据植物GA2氧化酶基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属荔波连蕊茶嫩枝为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 371 bp的GA2ox基因全长cDNA序列,命名为ClGA2ox1(GenBank登录号KJ502290)。[结果]序列分析表明,ClGA2ox1放阅读框(ORF)为1 002 bp,编码333个氨基酸,5'非编码区59 bp,3'非编码区310 bp。预测的蛋白质分子量为37.31 kD,等电点为5.92,具有GA2ox超基因家族的保守结构域和特有的氨基酸残基。ClGA2ox1蛋白与GenBank中收录的其它植物GA2ox蛋白氨基酸的相似性达到80%。构建系统进化树,结果显示山茶GA2氧化酶与烟草GA2ox蛋白的亲缘关系最为密切。实时定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同器官及发育不同时期的均有表达,表达量有所不同:ClGA2ox1基因在2年生茎段中的表达量最高,在嫩枝和根中也有较高的表达,而在新抽生的嫩叶中最低。[结论]试验结果为进一步明确ClGA2ox1基因的功能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制奠定基础。     

苹果属无融合生殖SERK1基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为探讨苹果属植物无融合生殖分子机制。[方法]以苹果属平邑甜茶及杂种后代33#为试材,以苹果基因组CDS序列设计引物,通过PCR扩增技术克隆出SERK同源基因的cDNA全长序列,命名为MhSERK1和MhdSERK1(GenBank登录号JQ231273和JQ231272),利用实时定量RTqPCR的方法检测了这两个基因在平邑甜茶和杂种后代各组织和器官中的表达模式。[结果]序列分析显示MhSERK1和MhdSERK1编码区序列全长为1 899 bp和1 881 bp,分别编码632和626个氨基酸,其氨基酸序列与其他植物的SERK1同源基因所编码的氨基酸同源性都在80%以上,特别是与葡萄科龙眼品种同源性最高,高达92.56%,与模式植物拟南芥、烟草等植物的SERK同源基因都具有很高的同源性。实时定量PCR结果表明,在平邑甜茶和杂种后代不同组织、花器官中SERK1基因的表达量存在差异,其中在子房中的表达量最高,在营养生长的组织中表达量很低,在平邑甜茶花蕾期的子房中表达量最高。[结论]推测该基因在平邑甜茶和杂种后代的生殖发育过程中可能发挥重要作用。     

松材线虫Bxpel2基因的克隆及RNA干扰载体构建

[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体.[方法]通过Trizol 法提取松材线虫总RNA,反转录合成cDNA,设计带T₇启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以cDNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况.[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至pMD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·mL^-1和1.152 mg·mL^-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制.[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础.     

白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Sf9中的表达

[目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS.[方法]将WS编码序列克隆到质粒pFastBac^TMHT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^TM,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid/EpelWS.将rBacmid/EpelWS转染Sf9细胞.[结果]免疫荧光标记检测表明:WS在受感染细胞的细胞质中表达.[结论]本研究成功表达了白蜡虫WS,为白蜡虫WS的生化特性研究奠定了基础.     

应用单拷贝核基因标记研究我国欧洲山杨自然居群的遗传多样性

[目的]对分布于我国新疆地区欧洲山杨自然居群的遗传多样性与遗传分化进行研究。[方法]对4个欧洲山杨自然居群共72个个体的6个单拷贝核基因标记(sing-copy nuclear markers)进行扩增与测序,并计算相应的遗传多样性和遗传分化参数。[结果]表明:比对后6个基因的长度在459 bp到747 bp之间,平均多态核苷酸位点个数为14,遗传多样性指数π和θ_w分别达到了0.004 8和0.004 4,基因多样性指数为0.73,以上结果表明欧洲山杨表现出较高的遗传多样性水平。Tajima中性检验结果均不显著,表明所用6个单拷贝核基因均符合中性进化假设。AMOVA分析表明89.72%的遗传变异存在于居群内,居群间的平均遗传分化指数F_st为0.10,居群间平均基因流(Nm)为3.235。[结论]高度异交,高碱基突变率及超长距离的基因流机制能够很好的解释我国新疆地区欧洲山杨表现出的较高的遗传多样性水平与较低水平的遗传分化。     

miR396在落叶松体细胞胚胎中的功能研究

[目的]探讨miR396在落叶松体细胞胚胎发生中的功能.以期该研究能为解决体胚发育中子叶畸形胚与生根率低的问题提供新的视角,同时也为进一步揭示体胚发育的分子调控网络做基础铺垫.[方法]构建pre-miR396超表达载体,通过农杆菌介导侵染,将pre-miR396转入落叶松胚性细胞中,筛选稳定抗性细胞系.在DNA与RNA水平上,对抗性细胞系进行的鉴定、检测,同时统计比对其与野生细胞系间发芽率、叶片数目以及生根率的差异.[结果]在抗性细胞系基因组中,扩增出HTP与miR396的特异性片段,且无农杆菌Virg基因片段.RNA表达水平上,抗性系pre-miR396与miR396表达皆增加,而靶基因LaGRFs的表达量下调.统计表明抗性系胚的发芽率、生根率、叶片数目畸形率分别为70.60%、0.60%、37%,而野生型分别为92.50%、10.55%、4%,抗性系胚的发芽率、生根率显著降低(Sig.=0.000),叶片数目畸形率显著增加(Sig.=0.000).[结论]miR396在落叶松体细胞胚胎发生过程中,可能通过负调节靶基因LaGRFs的表达或者通过LaGRFs影响与它相互作用的基因,参与体胚子叶原基细胞代谢,从而影响了子叶与叶片的发育;通过负调节LaGRFs或者其它与根部发育相关的靶基因,影响了根端分生区细胞的活动,参与调控根的发育.     

枣实蝇对寄主植物不同器官的选择性测定

[目的]为枣实蝇引诱剂的研发提供理论依据。[方法]从枣实蝇行为学研究入手,以“Y”型嗅觉仪分别测试了枣实蝇对红枣和杏两种寄主植物不同新鲜器官的选择行为。[结果]表明,不同性别的枣实蝇成虫对寄主植物枣和杏不同器官的选择性表现出一定差异。雌虫对枣果的选择性比叶片和花的要强（P<0.05）,对枣果、枣花、叶片三者的选择率分别为35%、25%、22%;从枣果不同发育期（青果期、半红期、全红期）的选择性来看,雌虫对半红期枣果的选择性最强,选择率为38%,青果次之,为35%。而雄虫对枣花的选择性较强,选择率为38%,半红期枣果次之,为32%。枣实蝇对杏树不同器官的选择性来看,对果实的选择性比叶片的选择性要强（P<0.05）,从杏果（青果、熟果）不同发育期的选择性来看,雌虫对青果的选择性最强,选择率为30%,熟果次之,为28%。雄虫对熟果的选择性较强,选择率为28%,与青果、叶片有显著差异（P<0.05）。[结论]同一性别不同生理状态的成虫对寄主植物不同器官的选择性表现出一定差异,性成熟的成虫比未性成熟的成虫对寄主植物的选择性要强。性成熟的枣实蝇雌成虫对半红期枣果的趋性强于枣花与叶片     

利用PMI选择标记进行杨树转基因体系的研究

[目的]利用不同于抗生素的PMI为选择标记基因的遗传转化体系,对杨树进行双抗虫基因(Bt和CpTI)的转基因研究.建立杨树以PMI为安全标记基因的转基因体系,为安全、高效的林木转基因育种研究提供实验依据.[方法]选择已有的转CpTI抗虫基因(利用Km^r选择标记获得)的美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus ×euramericana ‘Nanlin895’)为受体材料,对杨树叶片、叶片分化芽、茎段生根的甘露糖敏感性等筛选优化,采用农杆菌介导的方法进行双抗虫基因的研究.[结果]较为适合的杨树叶片筛选培养基为:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1;叶片分化芽筛选培养基为:甘露糖10 g·L^-1和蔗糖20 g·L^-1;茎段生根筛选培养基:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1.在此基础上,获得了转Bt和CpTI双抗虫基因的植株8株.[结论]初步建立了以PMI为安全标记基因的杨树转基因体系:确定了PMI筛选的最适选择压,成功构建了含PMI选择标记基因的植物抗虫表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化最终获得了转双抗虫基因植株.     

枝梢环剥对油橄榄莱星品种果实产量及叶片光合作用的影响

[目的]研究冬季半休眠期枝梢环剥对油橄榄成花、坐果及叶片碳氮营养、光合作用的影响,探讨环剥技术对油橄榄大小年结果的调控作用及环剥后较长时期内叶片光合作用调控机制.[方法]以16年生油橄榄'莱星'典型的大、小年树为试验材料,研究了冬季半休眠期枝梢环剥对油橄榄成花、坐果及叶片碳氮营养、光合作用的影响.[结果]冬季半休眠期枝梢环剥可显著提高油橄榄大、小年树次年花芽形成率和早期坐果率(花后30天),但对最终的坐果率、单个果实干鲜质量和果实产量无明显影响.环剥后30天,叶片可溶性糖含量显著升高,叶片淀粉含量明显升高,叶片全氮含量显著下降,叶片碳氮比值显著升高;叶片净光合速率(P_n)和气孔导度(G_s)显著下降,叶片胞间CO₂浓度(C_i)基本未变.之后,随处理时间延长,叶片中可溶性糖和淀粉含量积累效应基本消失时(处理后120 d),叶片P_n和G_s仍显著低于对照,叶片C_i显著高于对照.[结论]冬季半休眠期枝梢环剥可促进油橄榄成花,但果实产量无显著提高;莱星品种明显的结实大小年节律可能主要决定于其品种的发育节律和遗传本身.环剥后短期内叶片P_n的下降应与叶片中可溶性糖和淀粉积累有关.     

中间锦鸡儿CiDR1的克隆及干旱胁迫下的表达分析

[目的]研究并了解中间锦鸡儿CiDR1基因功能及其对干旱胁迫的响应,为抗性育种提供候选基因。[方法]通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆CiDR1基因的c DNA全长,利用生物信息学分析软件对其基因结构及功能进行分析和预测。再通过qRT-PCR技术对干旱胁迫后的幼苗中的CiDR1表达模式进行研究。[结果]从中间锦鸡儿中克隆到CiDR1基因的c DNA全长共计4 297 bp,Gen Bank登录号为KP277100。生物信息学分析表明,预测的CiDR1蛋白序列中含有1 243个氨基酸残基,具有抗病基因特征结构域TIR、NB-ARC、LRR等,其等电点为6.35,不稳定指数为42.91,不具备信号肽,为非分泌蛋白,定位于细胞质中。定量PCR检测发现,CiDR1基因在幼年期的茎中表达量较低,在成年期的叶片中表达量较高;在干旱胁迫处理后的幼苗中,CiDR1表达水平有明显下降,表明该基因的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关。[结论]中间锦鸡儿在干旱胁迫后其根、茎和叶中CiDR1的表达均明显下降,表明CiDR1的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关,进一步研究发现CiDR1在根、茎、叶中的表达水平可能受发育阶段调控。     

杨树PIF基因家族成员表达模式研究

[目的]为探究光敏色素相互作用因子(PIF)基因在杨树生长发育中的功能。[方法]利用生物信息学方法预测了杨树基因组中的PIF基因家族成员并对各成员的基因结构、保守基序进行了系统分析;在此基础上,采用实时荧光定量PCR技术检测了PIF成员在不同组织及低温、干旱和Na Cl胁迫下的表达模式。[结果]表明:杨树基因组中至少含有10个Pt PIF成员,这些成员在进化上相对保守,均具有典型的b HLH结构域。基因表达分析显示:Pt PIF基因在杨树不同组织及不同非生物胁迫条件下存在明显的表达差异。[结论]杨树Pt PIF基因家族包含10个成员参与不同的生物学过程,研究结果将为深入解析杨树Pt PIF基因的功能奠定了基础。     

麻疯树BRI1基因的鉴定及其在不同发育时期花蕾中的表达分析

[目的]研究油菜素内酯受体BRI1的同源基因(JcBRI1)在麻疯树花发育过程中的作用。[方法]利用RT-PCR技术克隆JcBRI1基因的CDS,以pET-30a(+)质粒为框架构建原核表达载体转化至大肠杆菌进行诱导表达,随后利用LC-MS/MS对表达产物进行质谱鉴定,并以氨基酸序列为基础分析JcBRI1蛋白质结构。利用荧光定量PCR分析麻疯树JcBRI1基因在雌雄花发育的关键时期的表达水平,初步确定其在麻疯树花发育过程中的表达模式。[结果]克隆获得了JcBRI1基因的CDS,长度为3 591 bp。SDS-PAGE检测结果表明:JcBRI1基因在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中均能表达,但在低温环境的表达量更高。原核表达产物的LC-MS/MS鉴定结果表明:JcBRI1氨基酸序列与预期的一致,JcBRI1基因的表达产物为麻疯树BRI1蛋白。对JcBRI1在麻疯树花器官不同发育时期的表达水平进行检测分析,结果表明:JcBRI1基因的表达量在雌花发育的第一个时期即大孢子母细胞时期就达到了最高值,在随后几个时期持续下调;然而,其在雄花各个时期的表达量并无明显差异,表明其很有可能参与了麻疯树雌花大孢子母细胞发育过程。[结论]麻疯树JcBRI1基因为LRR-RLKs家族成员BRI1的同源基因,很有可能参与麻疯树雌花大孢子母细胞的发育过程,至于JcBRI1在麻疯树大孢子母细胞发育过程中的具体作用机制还需进一步研究。     

3个海拔梯度对高节竹笋品质的影响

[目的]比较分析了不同海拔梯度高节竹笋外观品质、营养品质和食味品质的差异,为高节竹高品质竹笋培育提供参考。[方法]试验采集3个海拔梯度(110、370、560 m)的高节竹林竹笋,对竹笋外观品质、营养品质和食味品质指标进行调查测定。[结果]表明:海拔高度对高节竹笋基径、长度、笋个体质量、可食率和可溶性糖、维生素C、胱氨酸、酪氨酸含量、人体必需氨基酸比例及单宁、草酸含量有显著的影响(P0.05),对高节竹笋蛋白质、脂肪、淀粉、总黄酮、其它种类游离氨基酸、人体必需氨基酸含量和氨基酸总量及纤维素、木质素、苦味、鲜味、甜味氨基酸含量和甜味、鲜味氨基酸比例影响不显著(P0.05),对芳香味氨基酸含量和芳香味、苦味氨基酸比例有较显著的影响(P0.05)。[结论]海拔高度对高节竹笋外观品质有显著的影响,中、高海拔竹笋优于低海拔竹笋;海拔高度对竹笋营养品质、食味品质有较显著的影响,但对外观品质的影响更显著。     

马尾松谷胱甘肽过氧化物酶PmGPX6基因cDNA克隆及转化拟南芥耐旱性初步研究

[目的]克隆马尾松谷胱甘肽过氧化物酶基因,并对其进行功能研究。[方法]采用RACE技术克隆基因c DNA序列,实时荧光定量PCR检测基因在马尾松干旱胁迫下的表达模式,花序浸泡法转化拟南芥,并对转基因与野生型拟南芥的生长表型和根系生长进行分析。利用荧光显微镜技术对转基因拟南芥不定根进行GFP荧光检测。[结果]克隆到1个871 bp的GPX基因全长c DNA序列,命名为Pm GPX6。Pm GPX6包括513 bp的完整开放阅读框,编码170个氨基酸残基。Pm GPX6蛋白与油松Pt GPX蛋白同源性达95%。Pm GPX6在马尾松根中高表达,茎、叶中表达量低。在干旱胁迫下,Pm GPX6在根、茎、叶中的表达量均在第15天达到最大,随后出现下降趋势。过表达Pm GPX6与野生型拟南芥植株在正常水分条件下表型与根长差异不大,但在干旱胁迫下,转基因植株根系更长。转基因拟南芥根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光,表明Pm GPX6基因能高效表达。[结论]推测Pm GPX6可能参与马尾松干旱胁迫应答。     

角倍蚜及其寄主植物盐肤木游离氨基酸研究

[目的]明确角倍蚜、角倍与寄主盐肤木协同生长过程中游离氨基酸变化的营养关系。[方法]用全自动氨基酸分析仪Biochrom30+检测角倍发育初、中、后期的角倍蚜、角倍、有倍叶、无倍叶及无角倍盐肤木叶片(CK)的游离氨基酸含量,分析不同时期各试样游离氨基酸总量(FAA)、昆虫必需氨基酸总量(EAA)、昆虫必需氨基酸总量与检出物质总量比值(EAA/TAA)及几种游离氨基酸含量的变化。[结果]表明:不同时期各试样均检出32种游离氨基酸(包括17种蛋白氨基酸和15种非蛋白氨基酸),2种其他组分(不含氨),其中,游离氨基酸含量从大到小依次为角倍蚜(5.569)角倍(2.122)有倍叶(0.560)无倍叶(0.537)CK(-0.114)。从角倍生长初期至后期,角倍蚜体内必需氨基酸总量呈递增变化,而其他材料EAA/TAA变化幅度从大到小依次为CK(1.73%)有倍叶(0.52%)=无倍叶(0.52%)角倍(0.43%)角倍蚜(0.02%),但角倍蚜EAA/TAA稳定为(27.91±0.01)%,角倍蚜对寄主盐肤木叶片EAA/TAA的变化幅度有显著减缓影响。在角倍生长发育期间,角倍蚜体内精氨酸和苯丙氨酸含量均增加2.93倍;而寄主植物组织中脯氨酸含量发生变化,增幅大小为角倍(0.028)有倍叶(0.003)无倍叶(-0.001)CK(-0.018)。[结论]角倍蚜取食盐肤木不会改变寄主盐肤木叶片中游离氨基酸组分,但可使其游离氨基酸含量增加;在角倍生长过程中,盐肤木植株游离氨基酸总量与角倍蚜个体数量和角倍体积的增加趋势基本一致,反映了角倍蚜取食与盐肤木防御之间的平衡。     

杨树PtROP家族基因的表达分析与功能预测

[目的]为探究ROP基因在林木中的功能。[方法]本研究以杨树为模式,在全基因组水平上对ROP基因的家族成员、基因结构、保守结构域、氨基酸序列相似性及表达模式进行了分析。[结果]显示,杨树PtROP基因家族包含13个成员,不同成员间在进化上相对保守,均存在与GTP结合与水解相关的结构域。这些基因在不同组织、不同胁迫条件下的表达具有明显差异,说明它们参与不同的生物学过程。通过构建功能基因网络(functional gene network for poplar)发现PtROP基因主要参与了信号转导过程。[结论]杨树PtROP基因家族包含13个成员参与不同的生物学过程,可能主要参与了信号转导过程。     

刚毛柽柳Thb HLH1转录因子识别的顺式作用元件的鉴定

[目的]本研究拟对Thb HLH1所识别的顺式作用元件进行鉴定,进一步揭示Thb HLH1调控抗逆基因表达的机理。[方法]利用以转录因子为中心的酵母单杂交系统鉴定Thb HLH1所识别的顺式作用元件;将元件与报告基因融合构建报告载体(p CAM-Cis),通过基因枪法将报告载体与效应载体35S∶Thb HLH1共转化烟草叶片,在盐、干旱胁迫下比较GUS酶活。[结果]鉴定出2段能够与Thb HLH1转录因子结合的DNA序列:分别为CCGAAA(LTRE1)和TGAC(WRKY710S)。[结论]在盐或干旱胁迫下,Thb HLH1通过与LTRE1或WRKY710S元件作用来激活基因表达。     

巨桉EXP基因家族的生物信息学分析

[目的]本研究有助于了解EXP基因家族的基本特征,为深入研究其功能搭建平台。[方法]本研究对从巨桉(Eucalyptus grandis Hill)中筛选出35个EXP基因家族成员(Egr EXP1 Egr EXP35),利用生物信息学方法对其基因特征与表达模式进行综合分析。[结果]巨桉EXP基因分布在8条染色体之上,EXP蛋白均定位在细胞质膜上发挥作用,大多数的家族成员具有信号肽。巨桉EXP编码的蛋白质由α-螺旋、延伸链、无规卷曲、β-转角组成。进化分析结果表明,巨桉EXP蛋白与毛果杨(Populus trichocarpa) EXP蛋白的进化关系接近。35个巨桉EXP基因在巨桉未成熟木质部、成熟叶片、韧皮部、茎尖、木质部以及幼叶组织中表达模式存在显著差异。[结论]EXP基因家族各成员的表达模式不同,Egr EXP17、Egr EXP18可能在巨桉木材形成过程中起重要作用。