枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2电击转化体系的建立

[目的]建立枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株ZT4-2的高效电击转化体系.[方法]带有荧光蛋白标记的穿梭质粒pGFP78,通过电击转化法将其转入枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2.[结果]菌株培养阶段、感受态细胞浓度、感受态细胞量、质粒体积量、转化电压等条件的不同,会对电击转化效率造成影响.其中试验条件:制备感受态细胞的菌株培养阶段的OD600nm值=1.0,重悬菌体时每100 mL起始菌液加入600 μL的40％PEG6000;电击转化体系中,感受态细胞量200 μL,质粒体积10 μL,转化电压2.5 kV.最高转化效率可达6 823.67 CFU/μg.[结论]建立了枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2的电击转化体系,电击转化效率较高.     

侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽基因的初步定位

侧孢短芽孢杆菌S62-9可以产生高效广谱抑菌活性的细菌肽,为了确定该抗菌肽基因的遗传定位,本研究采用质粒消除和质粒转化进行正反论证。结果发现,电击法消除S62-9菌株的野生质粒pBLS62后,其突变株抑菌活性消失,而且对S62-9细菌肽的敏感性大大增强;而野生质粒pBLS62导入没有抑菌活性的枯草芽孢杆菌Wb800中,转化子Z4产生了抑菌活性,而且RP-HPLC结果表明Z4表达的抗菌物质与原始菌株S62-9抗菌肽为同一产物。从质粒消除和质粒转化与由此带来的表观性状的关系上,可以推断,侧孢短芽孢杆菌S62-9细菌肽及其免疫相关基因位于质粒而不是染色体上。     

贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5对烟草赤星病菌的拮抗研究

从山西运城盐湖泥中采样获得了贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5,为了确定其固体发酵产出的次代菌株是否有效拮抗烟草赤星病菌,进行了贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5的固体发酵,接着使用其次代菌株JW-5-AN和烟草赤星病菌进行平板对峙试验,并建立了一种平板对峙试验描述方法,提出了几个平板对峙试验描述术语,再结合显微检测,结果表明,贝莱斯芽孢杆菌JW-5-AN拮抗烟草赤星病菌,其进攻型拮抗速率为5.56 mm/d,防御型拮抗指数为0.5760,固体发酵次代菌株JW-5-AN的平板检测结果为5×108CFU/g.这表明贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5具有研发防治烟草赤星病菌微生物菌剂的潜力.     

大肠杆菌DH5a菌株高效电击转化条件的优化

为探索大肠杆菌DH5a高效电击转化条件，通过对电击转化条件中细胞生长状态、DNA加入量、感受态细胞体积、电场强度、速冻和恢复时间等关键因素进行优化，筛选出大肠杆菌DH5a高效电击转化条件。结果表明：大肠杆菌在细胞生长状态OD₆₀₀值为0.6时制备感受态细胞，按每管50μL体积分装、-80℃乙醇速冻后，加入10 pg pUC 19质粒DNA,在20 kv·cm^-1电场强度、电容25μF、电阻200Ω条件下电击转化，转化后恢复培养60 min,转化效率达10¹⁰ cfu·μg^-1 DNA以上水平，可满足基因文库构建、抗体库筛选等试验需求。     

3种芽孢杆菌在番茄生产过程中的应用效果研究

[目的]本研究旨在明确解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与贝莱斯芽孢杆菌在番茄生产过程中的应用效果。[方法]以中生菌素为化学对照药剂,采用田间小区试验,从植株生长、生化物质、青枯病防治效果及作物产量等4个方面展开研究。[结果]贝莱斯芽孢杆菌在株高和茎粗方面均显著优于解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌,与中生菌素的促生效果相当。贝莱斯芽孢杆菌处理的叶绿素含量、MDA含量、POD活性与IAAO活性均优于枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌,后两者在生化物质的含量或活性方面的表现较为接近。除POD活性显著低于中生菌素外,贝莱斯芽孢杆菌在其余生化物质指标方面均与中生菌素无显著差异。在青枯病防治效果方面,中生菌素为91.99%,贝莱斯芽孢杆菌为84.75%,解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆分别为63.08%和62.45%;在番茄产量方面,解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和中生菌素相对于CK分别增产18.48%、22.48%、29.87%及28.08%。[结论]3种芽孢杆菌均能起到防病增产的作用,其中以贝莱斯芽孢杆菌的效果最为明显,达到与中生菌素相当的效果。     

苏云金芽孢杆菌新疆分离株cry3基因的克隆和序列分析

从新疆天山北坡土壤及昆虫上分离到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株对鞘翅目害虫具有高毒力,其总DNA约为15 kb,以此为模板,并设计特异引物,扩增出800 bp和550 bp DNA片段,将回收的片段与pBS-T质粒连接,转化大肠杆菌（Escherichia coli）,用蓝白斑法筛选,将阳性克隆子（1号-5,700 bp左右、G4号-3,500 bp左右、G4号-4,720 bp左右）测序,与GenBank中已知的序列进行比对,结果表明1号-5与cry3基因家族的杀虫蛋白基因序列同源性可达84%~100%。     

一株蛋白酶产生菌的分离及鉴定

蛋白酶是一种重要的工业用酶制剂。本试验从土壤中筛选出1株产蛋白酶水平较高的菌株S-3,通过生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析,鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。本试验为贝莱斯芽孢杆菌应用于蛋白酶生产提供了依据。     

GFP标记的短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）转座突变株的构建初探

以水稻叶面附生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus)为研究对象,通过构建pMOD-egfp-Tetr转座复合体,采用电击转化法对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的转化子。对转化子进行了遗传稳定性分析和分子鉴定,并且在荧光显微镜下观察到了强烈的绿色荧光,研究结果表明外源DNA已经成功整合进细菌的基因组中,gfp基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达。     

一株蛋白酶产生菌分离及鉴定

蛋白酶在饲料加工行业中有广泛应用。为了获得高产蛋白酶菌株,本实验采用透明圈法进行初筛,通过Folin-酚法进行复筛,从土壤中获得了一株产蛋白酶能力较高的菌株S-3。通过生理生化反应和16S rDNA基因分析,鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。本实验为贝莱斯芽孢杆菌应用于蛋白酶生产提供了理论依据。     

基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌C44发酵参数

对贝莱斯芽孢杆菌C44发酵条件进行优化,可提高其菌落数和抗菌活性,为该菌株工业化生产提供理论依据。以贝莱斯芽孢杆菌C44为供试菌株,对培养基、氮源、碳源、无机盐、pH、温度、转速、装液量、接种量等因素进行单因素试验,研究其对C44菌落数和抗菌活性的影响;并以此为基础,以菌落数为考察指标,通过PlackettBurman试验、最陡爬坡试验和响应面试验等方法对其进行优化,选出菌落数生长最优发酵条件。单因素试验结果显示,LB培养基上贝莱斯芽孢杆菌C44的菌落数和抑菌圈直径均最高,且明显高于其他培养基;C44菌落数和抑菌圈直径在以10 g/L胰蛋白胨为碳源、10 g/L酵母提取物为氮源、10 g/L磷酸氢二钠为无机盐、pH值为7.1～7.4、温度为30℃、转速为180 r/min、装液量为100 mL、接种量为5%的条件下达到最高。Plackett-Burman试验从8个影响因素中筛选出对菌落数生长影响极显著的因素为磷酸氢二钠、温度、转速,采用最陡爬坡设计和BoxBehnken中心组合设计3因素3水平试验,得到对菌落数生长和繁殖影响最大的是磷酸氢二钠,其次是转速,温度影响最小。贝莱斯芽孢杆菌C...     

贝莱斯芽孢杆菌JTB8-2对加工番茄促生作用及其安全性评价

【目的】研究新疆加工番茄田土壤中获得的贝莱斯芽孢杆菌JTB8-2对加工番茄促生作用和安全性。【方法】采用种子催芽、穴盘育苗和盆栽试验方法。【结果】贝莱斯芽孢杆菌JTB8-2菌株发酵菌液25、50和100倍稀释液处理的加工番茄植株株高、茎粗、茎鲜重和根鲜重均显著高于空白对照;菌株JTB8-2发酵液25倍液、50倍液和100倍液处理的番茄植株茎鲜重显著高于NB培养基25倍液、50倍液、100倍液和空白对照;菌株JTB8-2菌株发酵液原液对20种作物种子萌发和芽生长具有抑制作用,25倍及以上稀释液对作物种子萌发和芽生长无影响。【结论】贝莱斯芽孢杆菌JTB8-2菌株发酵液能够促进番茄植株生长,其发酵液原液不宜做作物浸种处理,发酵液25倍及以上稀释液可以浸种。     

枯草芽孢杆菌224 yplQ基因敲除及其对溶血性的影响

为了确定枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)的溶血基因或引起溶血的主效基因,以枯草芽孢杆菌224基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0 kb和yplQ基因下游0.5 kb两段DNA序列,并以携带新霉素抗性基因的重组质粒pMD18-T-neo为骨架,构建基于yplQ基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yplQ,线性化后电转化至枯草芽孢杆菌224,通过新霉素抗性平板得到36个neor抗性转化子,基因组PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定yplQ18为yplQ基因缺失菌株,将其接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,仍能引起溶血。结果表明,单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体上yplQ基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。     

利用组成型表达载体pMG36e电转化乳酸乳球菌ML23的研究

为了探明乳酸菌电转化的最适条件,提高电转化效率,本试验以大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,以乳酸乳球菌ML23为受体,利用电转化方法研究了受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电场强度、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响。结果表明:含2%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖的MRS培养基培养至对数生长中期的细胞,在电场强度11.0 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,转化后细胞在SMRS培养基中培养2 h,获得了较高的电转化效率。采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率又提高了15倍以上,达1.05×105CFU/μg DNA。     

生防假单胞菌FD6电击转化条件的优化

不同细菌电击转化效率各异,为筛选防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)FD6电击转化最佳条件,选取具卡那霉素抗性标记的质粒pBBR-rpoD,从电场强度、电击时间、质粒添加量、电击悬浮溶液和细菌生长阶段5个方面优化电击转化条件.结果表明:当细菌培养至D600nm值1.4左右时,在电场强度为12 kV·cm-1、电击时间为4 ms、质粒添加量为200 ng,并以1 mmol·L-1 HEPES作为电击悬浮溶液时转化效率最高,可达1.1×105转化子?μg-1(DNA).此外,HEPES浓度的改变并未对转化效率产生影响.这一研究建立了一套防御假单胞菌FD6的高效电击转化体系,为今后该菌株在分子水平上的遗传操作提供了重要参考.     

耐盐柳树抗虫基因Cry3A重组表达载体的构建

将苏云金芽孢杆菌Cry3A类抗虫基因经Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后与植物表达载体p CAMBIA1304-C6连接,构建p CAMBIA1304-C6-Cry3A重组表达载体,将其转化到农杆菌LBA4404中,同时进行双酶切、测序及PCR鉴定。结果表明:双酶切及测序产物与预期扩增片段相符,重组表达载体p CAMBIA1304-C6-Cry3A构建成功;农杆菌LBA4404中含有重组质粒,成功构建了Cry3A农杆菌基因工程菌株。     

利用响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌ZJ20发酵参数

【目的】优化贝莱斯芽孢杆菌的培养条件,以提高其菌落数和抗菌活性,为该菌株工业化生产提供理论依据。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌ZJ20为供试菌株,采用单因素试验,研究培养基、pH、温度、转速对ZJ20菌落数和抗菌活性的影响;在此基础上,以菌落数为考察指标,采用响应面法对pH、温度、转速3个因素进行进一步的优化,得到了贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的最佳培养条件;最后在温室采用盆栽试验,研究最佳培养条件得到的贝莱斯芽孢杆菌ZJ20对杂交竹梢枯病的防治效果。【结果】单因素试验结果显示,供试培养基中,NB培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH 7.0～7.2)上贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均最高,分别为4.11×108 CFU/mL和6.10mm,且显著高于其余培养基,说明NB培养基更有利于贝莱斯芽孢杆菌的生长。当pH为4～10时,随着pH的增加,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降,其中当pH为7～8时ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均显著高于其他处理;在此基础上的复筛结果显示,7.0～7.4为贝莱斯芽孢杆菌的最优pH。当转速为140～200r/min时,随着转速的增加,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降,其中当转速为160～180r/min时,菌落数和抑菌圈直径均较高。温度为22～30℃时,随着温度的升高,菌落数和抑菌圈直径均先增加后下降,其中当温度为22～28℃时菌落数和抑菌圈直径均较高。响应面试验结果显示,3个因素中,转速对菌落生长和繁殖的影响最大,其次是温度,影响最小的是pH,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20最优培养条件为:pH 7.27,转速160r/min,温度28℃,在此条件下测定的菌落数为769×107 CFU/mL。盆栽试验结果显示,优化培养条件下得到的ZJ20悬液防治效果明显提高,均超过50%。【结论】得到了贝莱斯芽孢杆菌的最佳培养条件,这不仅使其菌落数增加,而且极大地增强了该菌的抗病活性。     

马来西亚植物根际土壤芽孢杆菌的鉴定及其对水稻白叶枯病防治效果

[目的]拟从马来西亚植物根际土壤中分离和鉴定抑菌能力强的芽孢杆菌菌株,并对菌株产生的脂肽类抗菌物质的种类以及生防效果进行研究。[方法]采用平板对峙试验,筛选具有抑制水稻白叶枯病菌和油菜菌核病菌的芽孢杆菌,基于16S r DNA、gyr B基因序列对分离菌株进行分类鉴定,采用基质协助激光解吸附/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法鉴定菌株所产生的脂肽类抗生素的种类,并通过温室试验对菌株防治水稻白叶枯病的效果进行研究。[结果]拮抗试验结果表明:D15、W3、Klu7、YM16、D1和PLZ26这6株菌株对水稻白叶枯病菌或油菜菌核病菌具有较强的抑制活性,其中菌株D15和W3对这2种病原菌都具有抑制活性。基于16S r DNA和gyr B基因的系统发育分析表明:菌株D15和W3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);菌株Klu7属于短小芽孢杆菌(B.pumilus);菌株YM16属于蜡样芽孢杆菌(B.cereus);菌株D1和PLZ26属于苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。MALDI-TOF-MS检测结果表明:菌株PLZ26和Klu7能产生脂肽类抗生素Surfactin;D15和W3能产生脂肽类抗生素Iturin A。温室生防试验结果表明:菌株PLZ26对水稻白叶枯病具有较好的防治效果。[结论]本研究为生物农药的研发提供了优良的菌株资源。     

顺反子序列bioI-orf2-orf3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioI-orf2-orf3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747。从5μg/m l的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上。     

利用响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌ZJ20发酵参数

【目的】优化贝莱斯芽孢杆菌的培养条件，以提高其菌落数和抗菌活性，为该菌株工业化生产提供理论依据。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌ZJ20为供试菌株，采用单因素试验，研究培养基、pH、温度、转速对ZJ20菌落数和抗菌活性的影响；在此基础上，以菌落数为考察指标，采用响应面法对pH、温度、转速3个因素进行进一步的优化，得到了贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的最佳培养条件；最后在温室采用盆栽试验，研究最佳培养条件得到的贝莱斯芽孢杆菌ZJ20对杂交竹梢枯病的防治效果。【结果】单因素试验结果显示，供试培养基中，NB培养基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.2）上贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均最高，分别为4.11×108 CFU/mL 和6.10 mm，且显著高于其余培养基，说明NB培养基更有利于贝莱斯芽孢杆菌的生长。当pH为4~10时，随着pH的增加，贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降，其中当pH为7~8时ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均显著高于其他处理；在此基础上的复筛结果显示，7.0~7.4为贝莱斯芽孢杆菌的最优pH。当转速为140~200 r/min时，随着转速的增加，贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降，其中当转速为160~180 r/min时，菌落数和抑菌圈直径均较高。温度为22~30 ℃时，随着温度的升高，菌落数和抑菌圈直径均先增加后下降，其中当温度为22~28 ℃时菌落数和抑菌圈直径均较高。响应面试验结果显示，3个因素中，转速对菌落生长和繁殖的影响最大，其次是温度，影响最小的是pH，贝莱斯芽孢杆菌ZJ20最优培养条件为：pH 7.27，转速160 r/min，温度28 ℃，在此条件下测定的菌落数为769×107 CFU/mL。盆栽试验结果显示，优化培养条件下得到的ZJ20悬液防治效果明显提高，均超过50%。【结论】得到了贝莱斯芽孢杆菌的最佳培养条件，这不仅使其菌落数增加，而且极大地增强了该菌的抗病活性。     

顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747.从5μg/ml的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上.