牛副性腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶性质的测定

以牛副性腺部分纯化的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶为材料,以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学。结果表明:牛副性腺NAGase的最适pH为5.5,在pH3.0～7.6区域内活力较稳定,而在pH7.6能很快失活;最适温度为55℃。在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃酶稳定性较差。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.48mmol/L,最大反应速度Vm为19.73umol/(L·min)。酶催化pNP-NAG水解反应的活化能为69.77kJ/mol。     

番鸭 (Cairina moschata ) 睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的提取及性质研究

以番鸭睾丸为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为19.18 U/mg、纯化倍数为6.46倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学。结果表明：酶的最适pH为5.6,该酶在pH3.0～7.6区域较稳定,而在pH〉7.6能很快失活;酶的最适温度为55℃。当温度为80℃时,酶完全失活。在40℃以下处理30 min,酶活力保持稳定,高于45℃,酶稳定性较差。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.215 mmol/L,最大反应速度Vm为5.54μmol/L.min。酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为69.05kJ/mol。金属离子对酶的效应试验表明：高浓度的Na＋和K＋对酶有抑制作用;Mg^2＋对酶有轻度激活作用,Cu^2＋、Pb^2＋、Zn^2＋、Ca^2＋、Ba^2＋对酶活力有不同程度的抑制作用;Al3＋对酶有抑制作用。     

枯草芽孢杆菌JNB001蛋白酶特性的研究

为了解枯草芽孢杆菌JNB001发酵所产蛋白酶的特性,试验以蛋白酶活力为指标,研究了pH、温度等因素对酶促反应的影响,并通过水解度考察了粗酶液对各种动物蛋白的酶解效果。结果表明,酶反应最适pH为8.0,温度为45 ℃;粗酶液在pH 5.5~9.0的范围内较稳定,过碱则不利于酶液的保存。在45 ℃下热稳定性良好,超过50 ℃保温10 min后残余酶活已不足60%;金属离子Ca²⁺和Mg²⁺、还原剂DTT、表面活性剂Tween-80等能大幅度提高酶活力。而Fe²⁺、Cu²⁺、金属螯合剂EDTA、变性剂SDS等物质则会抑制蛋白酶活性;酶促反应的K_m为6.43 mg/mL,V_max为47.39 μg/min;针对不同蛋白底物,酶促反应较适pH为 7.0~9.0,温度为40~50 ℃。该粗酶液具有水解猪毛、猪蹄甲、脱毛牛皮、明胶等硬蛋白类物质的能力。上述试验结果可为枯草芽孢杆菌JNB001在病死畜禽无害化生物处理体系等方面的工业应用提供参考。     

糖对长白猪精液NAGaseⅡ的抑制机理

以长白猪精液为材料,采用经典的纯化方法获得N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（EC 3.3.1.52,NAGase）的2种同工酶,命名为：NAGaseⅠ和NAGaseⅡ。其中NAGaseⅡ的比活力为358.21U/mg,纯化倍数为6.37倍。以海藻糖、D-甘露糖、蔗糖、葡萄糖为效应物,研究其对该酶活性的影响。结果表明：在特定浓度范围内,海藻糖对酶活力基本没有影响;D-甘露糖、蔗糖、葡萄糖对该酶均有一定的抑制作用;D-甘露糖对酶的抑制作用表现为非竞争型,抑制常数KI为11.94mmo/L;蔗糖对酶的抑制作用表现为竞争型,抑制常数KI为0.56mmol/L;葡萄糖对酶的抑制作用表现为混合型,抑制常数KI和KIS分别为0.35mol/L和64.29mmol/L。     

黄色瘤胃球菌木聚糖酶基因xynB的异源表达与酶学性质研究

该试验以黄色瘤胃球菌基因组为模板,通过PCR扩增获得目的基因xynB,将xynB与表达载体PET28a连接,获得重组载体PET28a-xynB。用IPTG对含有重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,镍离子层析柱纯化后检测其酶学性质。生物信息学分析表明,XynB理论大小为47 kDa,预测等电点为4.49,不含信号肽,含有1个糖苷水解酶11家族结构域和1个碳水化合物结合结构域。酶学性质研究结果表明,该酶的最适pH值为5.0,最适反应温度为40℃,金属离子Mg²⁺、Na⁺、K⁺和Ba²⁺对木聚糖酶XynB有较好的激活效果。综上可知,黄色瘤胃球菌木聚糖酶XynB属于GH11家族,最适pH值为5.0,最适温度为40℃,酶比活力为62.94 U/mg。     

枯草芽孢杆菌酸性内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质

将来源于藏猪粪便的枯草芽孢杆菌BY-4菌株接种于含4%麸皮的产酶培养基中,37℃、220r/min培养48h,发酵上清液经HiTrap Phenyl HP疏水作用层析、HiPrep 16/60Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化得到一个内切葡聚糖酶组分,纯化倍数为15.5,回收率为25.0%。经SDS-PAGE、酶谱分析鉴定,两步分离纯化后为电泳纯的纤维素酶,相对分子量约为55 000。酶学性质研究表明,该酶的最适反应pH为4.5,最适反应温度为60℃。Mg2+、Zn2+对该酶有一定的激活作用,而Mn2+、Co2+、Ag+对该酶产生了抑制作用。     

番鸭肝脏碱性磷酸酶的分离及部分性质研究

对番鸭肝脏组织的碱性磷酸酶进行分离,测定分离纯化不同阶段的碱性磷酸酶的活性。利用有机溶剂分离提纯番鸭肝脏中的碱性磷酸酶,并对其酶促动力学性质进行研究。结果表明:该酶的纯化倍数达3.1倍,比活力为476.8U/mg;催化磷酸苯二钠的水解反应时的最适温度为50℃,最适pH为9.7;米氏常数(Km)为5.28mmol/L。     

β-葡聚糖酶的酶学性质研究

采用DNS法对β-葡聚糖酶的酶学性质进行了研究,研究结果表明:该酶的最适反应温度为40~50℃;最适反应pH为7.5,在pH4.5～9有较大的活性区间;有较强的耐碱性,在pH5.5～11处理1h仍有超过90%的活性;Mn2+对β-葡聚糖酶有一定的抑制作用,其他金属离子和螯合剂对酶活没有明显的激活或抑制作用;该酶抵抗胃蛋白酶的能力较强,胰蛋白酶对该酶有一定的促进作用;该酶的米氏常数Km=0.795mg/mL,最大反应速度Vmax=8.547μmol/(mg/min)。     

一株高产内切纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌的产酶条件优化及酶学性质分析

试验旨在对一株杜仲树皮内生菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的内切纤维素酶(CMCase)进行产酶条件优化及酶学性质分析,为探究贝莱斯芽孢杆菌CMCase的相关特性提供参考依据。采用单因子试验设计,分别优化pH、接种量、温度、时间、碳源和氮源等发酵条件,并探讨温度、pH、底物专一性、金属离子及表面活性剂对CMCase的影响。结果表明,以玉米秸秆为碳源(30 g/L)、豆粕为氮源(30 g/L)、3%接菌量、pH 7.0的条件下37℃培养48 h,贝莱斯芽孢杆菌157的CMCase最高可达(5.14±0.18) U/mL。经CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157的最适酶反应温度为60℃,最适pH为5.0;温度稳定性试验发现,在40和50℃时,相对剩余酶活力均高于80%,随着温度的升高,酶活力逐渐降低,当温度高于55℃,相对剩余酶活力约为50%;pH稳定性试验发现,在pH 5.0～10.0之间耐受性良好,相对剩余酶活力均高于90%,随作用时间的延长,相对剩余酶活力变化不大。贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase属于典型内切型纤维素酶。Na^+、Mg²⁺、Ca²⁺可促进贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase酶活力,而Co²⁺、Hg²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和SDS抑制CMCase酶活力;表面活性剂Tween-80、Tween-20、Triton X-100对贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase无影响。本试验通过对贝莱斯芽孢杆菌157进行产酶条件优化及CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase具有产酶量高,耐受pH范围广的特点,在饲料添加剂、洗涤剂和造纸领域中具有一定的应用价值。     

大麦芽阿魏酸酯酶的分离纯化及其部分酶学性质的测定

本试验采用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析对大麦芽中的阿魏酸酯酶(FAE)进行了分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果显示,分离纯化后获得了阿魏酸酯酶纯品,纯化倍数达34倍;经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,并测定其相对分子质量约为29.3 ku;最适反应温度为50℃;最适pH为5.5,但阿魏酸酯酶在60℃以下,pH 4.5~7.5之间有较好的稳定性;Zn2+、Cu2+、Fe3+对酶活有很强的抑制作用,Na+和EDTA对酶有一定的激活作用。     

Study on Protease Properties of Bacillus subtilis JNB001

This experiment was aimed to study the protease properties produced by Bacillus subtilis JNB001 via the index of protease activity to investigate the effects of pH,temperature and other factors on the enzymatic reaction,and the ability of the crude enzyme solution to hydrolyze various animal protein was measured by the degree of hydrolysis.The results showed that the most suitable pH of reaction was 8.0 and the temperature was 45 ℃.The crude enzyme solution in the range of pH 5.5 to 9.0 was relatively stable,while it was not suitable for the preservation of the enzyme solution when pH was over 9.0.At 45 ℃ it had good thermal stability when exceed 50 ℃ for 10 min, the residual activity had been less than 60%.Metal ions such as Ca²⁺ and Mg²⁺,reducing agent like DTT,surfactant as Tween-80,etc.could greatly improve the enzyme activity.On the opposite,Fe²⁺ and Cu²⁺ as well as other ions,metal chelator EDTA,denaturant SDS and other materials could inhibit the protease activity.The K_m was 6.43 mg/mL,and V_max was 47.39 μg/min.It had a range of reaction pH from 7.0 to 9.0 and temperature from 40 to 50 ℃ in the situation for different protein substrates.The crude enzyme solution could hydrolyze pig hair,pig nail,hair removal of cowhide,gelatin and other hard protein substances.The results provided the strong date support for the Bacillus subtilis JNB001 which could be used in dead livestock harmless biological treatment system and other aspects of industrial applications.     

猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响

旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性，同时，分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影响以及胞外产物对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。猪霍乱沙门菌胞外产物具有降解λDNA的DNA酶活性，高温和酸性条件抑制DNA酶的活性，活性最适温度和pH分别为42℃和9.0，且胞外产物的核酸酶可被60℃以上的温度灭活。添加Na⁺、K⁺、Ca²⁺和Ni²⁺对胞外产物切割λDNA的活性没有影响；5.00和10.00 mmol·L^-1的Ba²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺可提高胞外产物的DNA酶活性；0.01~1.00 mmol·L^-1的Zn²⁺、Cu²⁺和Fe³⁺对胞外产物的DNA酶活性具有促进作用，但Co²⁺则表现出抑制作用。荧光显微镜和定量分析均显示，猪霍乱沙门菌不能刺激巨噬细胞释放胞外诱捕网，而猪霍乱沙门菌胞外产物可显著降解白色念珠菌刺激巨噬细胞形成的胞外诱捕网。本研究证实了猪霍乱沙门菌胞外产物的DNA酶活性，为进一步探究胞外产物在猪霍乱沙门菌感染与宿主免疫互作中的作用提供参考。     

猪肠道中产蛋白酶解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及其酶学性质的初步研究

试验从健康猪肠道中筛选得到一株高产蛋白酶的芽孢杆菌MY-6菌株,通过形态学观察、生理生化试验和糖醇发酵试验、16S rDNA序列扩增与比对、Biolog鉴定等方法鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。并研究了蛋白酶活力与细菌生活周期的动态关系,pH、温度、金属离子和蛋白酶抑制剂对蛋白酶活力的影响及蛋白酶对不同底物的水解性能。结果显示,MY-6菌株蛋白酶的合成与其芽孢形成同步,均开始于对数生长期的前期,该菌株所产蛋白酶的最适作用条件为：40℃、pH 7.0,Ca²⁺和Mn²⁺对蛋白酶活力有明显的促进作用,PMSF能够完全抑制该蛋白酶的活力,说明该蛋白酶属丝氨酸蛋白酶,蛋白酶对鱼粉蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、酪蛋白的酶解物TCA可溶性肽含量分别为0.83、0.67、0.58和0.38 μmol/g。结果提示,解淀粉芽孢杆菌MY-6菌株可作为改善蛋白质消化的益生性芽孢杆菌的初步选择。     

Screening and Identification of Protease-producing Bacillus amyloliquefaciens from Pig's Intestines and the Preliminary Study of Its Enzymatic Properties

A Bacillus strains,MY-6 strain which secreted high amount of protease was isolated from healthy pig's intestines,and it was identified as Bacillus amyloliquefaciens by the methods of morphological observation, biochemical tests,16S rDNA sequence amplification and comparison, biolog identification. In order to get an initial understanding of the enzymatic properties of its protease, the dynamic relationship between protease activity and bacterial life cycle, effects of pH,temperature,metal ions and inhibitors on protease activity,and the protease hydrolysis of different substrates were investigated. The results showed that,the protease synthesis of MY-6 strain was synchronized with its spore formation which began in the early stage of the exponential growth phase. The optimum conditions for the protease was 40℃ and pH 7.0,Ca²⁺ and Mn²⁺ had a intensive effects on the protease activity, PMSF could completely inhibit the activity of protease, indicating that the protease was a serine protease.The content of TCA soluble peptides for protein hydrolyzate fish protein, soybean protein, corn protein and casein was 0.83,0.67,0.58 and 0.38 μmol/g,respectively. In conclusion,Bacillus amyloliquefaciens MY-6 strain could be used as an initial selection of probiotic Bacillus to improve protein digestion.     

产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

试验从萌发的花魔芋实生种子中筛选出一株产β-甘露聚糖酶的内生菌,对该菌株进行鉴定并研究所产β-甘露聚糖酶的酶学性质。采用透明圈法初筛,DNS法测酶活力,摇瓶发酵复筛获得产酶最高的菌株,利用16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定并对所产酶的基本酶学性质进行研究。结果显示,该高产β-甘露聚糖酶的内生菌株与路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）同源性达99%。所产β-甘露聚糖酶的最适温度为60℃,在30~50℃条件下较稳定;最适pH为6.0,在pH 4.0~9.0的条件下较稳定;Zn²⁺（117.84%）、EDTA（115.80%）、Cu²⁺（113.76%）对β-甘露聚糖酶有较强的激活作用,Mn²⁺（22.02%）对其有强烈的抑制作用;以魔芋粉为底物时,Km值为26.65 mg/mL。该菌摇瓶发酵72 h后,β-甘露聚糖酶酶活力达9.48 U/mL,具有良好的酶学性质,在动物饲料工业中具有广阔的应用前景。     

产蛋白酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学特性分析

为了分离筛选产蛋白酶芽孢杆菌,以开发新型饲料添加剂,本研究选取小鼠肠道内容物为样品,通过对样品进行预处理以及酪蛋白平板检测法分离筛选获得产蛋白酶芽孢杆菌,对该菌进行形态学和分子生物学鉴定并分析其生长规律、产酶规律以及所产蛋白酶的酶学特性。结果表明,经形态学和分子生物学鉴定该菌为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis),其所产蛋白酶的最适反应条件为50℃,pH=8.0,具有一定的高温耐受性,在弱酸、中性和弱碱性条件下表现出一定的稳定性,Ca²⁺和Mn²⁺能够显著提高酶活(P<0.05),Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺和EDTA、尿素溶液对蛋白酶活力具有显著抑制作用(P<0.05),培养至16 h菌体量达到最大值,发酵22 h上清液中的蛋白酶活力达到最高值(57.77 U/mL)。该芽孢杆菌的成功筛选分离以及其所产蛋白酶的分析研究,为新型饲料添加剂的开发利用提供了物质基础。     

磷对铝胁迫紫花苜蓿幼苗根系生长和生理特征的影响

为了探究磷对铝胁迫下紫花苜蓿幼苗生长和生理特征的影响,分别用不含和含200 μmol·L^-1磷（P）、100 μmol·L^-1铝（Al）、200 μmol·L^-1 P+100 μmol·L^-1 Al的简易 ［Ca（NO₃）₂］营养液（pH=4.5）处理铝敏感紫花苜蓿品种‘Wl440’幼苗。结果表明,在铝处理中添加磷后,苜蓿幼苗根系和叶片中的铝含量分别比铝处理降低81.53%和61.47%,苜蓿幼苗的根长和根系活力显著提高,叶片电导率和丙二醛（MDA）含量显著下降;光合生理得到明显改善,与铝处理相比,磷添加处理幼苗叶片的叶绿素含量、蒸腾速率、气孔导度和光合速率明显提高,光系统Ⅱ和光系统I的电子传递速率增加;磷添加处理明显提高了铝胁迫苜蓿根系的草酸和苹果酸含量,体内有机酸螯合铝离子的能力增强,光合能力提高。因此,磷能够通过增加根系有机酸含量,改善铝胁迫苜蓿光合系统,从而缓解苜蓿铝毒害。     

瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因的表达与酶学特性研究

旨在表达来源于瘤胃厌氧真菌基因组的4个木聚糖酶基因A、C、D和F,并比较分析其酶学特性。首先根据大肠杆菌基因编码偏好,合成可在大肠杆菌中表达的木聚糖酶基因序列,然后采用同源重组的方法将各序列分别插入载体pET-28a中,在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中异源表达,并研究其酶学特性,结果成功表达出来源于厌氧真菌的4个木聚糖酶基因。测定其酶学性质发现,4种木聚糖酶的反应最适pH值均为8.0;木聚糖酶D的反应最适温度为37℃,其余3种木聚糖酶的反应最适温度均为45℃;4种木聚糖酶具有广泛的温度稳定性和pH稳定性;金属离子Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺显著促进木聚糖酶活性(P<0.05),而Zn²⁺则有明显的抑制作用(P<0.05);4种木聚糖酶降解山毛榉木聚糖的能力显著高于其他底物(P<0.05)。本研究成功表达了4种来源于厌氧真菌的木聚糖酶,其良好的温度和pH稳定性具有潜在的工业应用价值。