副猪嗜血杆菌OmpP2刺激猪肺泡巨噬细胞炎性因子mRNA转录及致炎机制初步分析

为了研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)弱毒株11型H465株OmpP2刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs)炎性因子mRNA的转录和对NF-κB和MAPKs信号通路的影响,提取并纯化HPS血清11型H465株的OmpP2,分别用5、10μg·mL-1 OmpP2刺激PAMs 6、12h后收集细胞,提取总RNA和蛋白质。将提取的RNA反转录成cDNA,运用RT-PCR检测炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA转录水平。利用Western blot方法检测ERK1/2、JNK、P38、P65和IκBα蛋白表达量的变化。结果表明:HPS H465株的OmpP2能够显著地诱导IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平上调(P0.05),同时能够引起JNK、P65蛋白表达水平显著升高和IκBα蛋白表达水平显著降低(P0.05)。上述结果证实了HPS血清11型H465株的OmpP2能够通过调节MAPKs信号通路中JNK蛋白以及NF-κB信号通路中P65蛋白和IκBα蛋白降解促进炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的转录。     

致病性大肠杆菌HPI对Caspase-1细胞焦亡相关分子表达的影响

为研究云南撒坝猪致病性大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)致猪源巨噬细胞焦亡的分子机制,本试验以云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI阳性株感染猪源巨噬细胞为切入点,从云南楚雄州某规模养殖场采集撒坝猪仔猪黄白痢的粪便,对大肠杆菌进行分离纯化,并通过PCR技术对HPI irp2基因进行检测,分别以HPI阳性株(HPI~+)和阴性株(HPI~-)感染巨噬细胞,并设立LPS+ATP组和空白对照组,于0.5和6 h收集各组细胞及其上清。应用实时荧光定量PCR法检测不同组Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平的变化;应用ELISA检测细胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量的变化。结果显示,试验成功分离得到致病性大肠杆菌,经PCR检测成功获得HPI irp2基因阳性株,经实时荧光定量PCR法检测后发现HPI~+组、HPI~-组与空白对照组相比,Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平均呈上调趋势,且HPI~+组高于HPI~-组。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,HPI~+组和HPI~-组pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的蛋白表达量普遍呈上调趋势,且HPI~+组均高于HPI~-组。结果表明,云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI可通过上调猪源巨噬细胞中Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表达量促进猪源巨噬细胞炎性因子IL-1β和IL-18的释放,诱发炎症,最终促进猪源巨噬细胞发生细胞焦亡。     

致病性大肠杆菌HPI对Caspase-1细胞焦亡相关分子表达的影响

为研究云南撒坝猪致病性大肠杆菌高致病性毒力岛（HPI）致猪源巨噬细胞焦亡的分子机制,本试验以云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI阳性株感染猪源巨噬细胞为切入点,从云南楚雄州某规模养殖场采集撒坝猪仔猪黄白痢的粪便,对大肠杆菌进行分离纯化,并通过PCR技术对HPI irp2基因进行检测,分别以HPI阳性株（HPI⁺）和阴性株（HPI^-）感染巨噬细胞,并设立LPS+ATP组和空白对照组,于0.5和6 h收集各组细胞及其上清。应用实时荧光定量PCR法检测不同组Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平的变化;应用ELISA检测细胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量的变化。结果显示,试验成功分离得到致病性大肠杆菌,经PCR检测成功获得HPI irp2基因阳性株,经实时荧光定量PCR法检测后发现HPI⁺组、HPI^-组与空白对照组相比,Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平均呈上调趋势,且HPI⁺组高于HPI^-组。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,HPI⁺组和HPI^-组pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的蛋白表达量普遍呈上调趋势,且HPI⁺组均高于HPI^-组。结果表明,云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI可通过上调猪源巨噬细胞中Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表达量促进猪源巨噬细胞炎性因子IL-1β和IL-18的释放,诱发炎症,最终促进猪源巨噬细胞发生细胞焦亡。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达

为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp~2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。     

蒲公英提取物对LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子分泌的影响

采用MTT法检测蒲公英提取物对LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞的毒性作用,并应用ELISA法测定蒲公英提取物对脂多糖LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-β的含量.结果表明,蒲公英提取物在≤1 mg/mL剂量范围内对巨噬细胞无细胞毒作用,对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α,IL-6和IL-1β分泌具有明...     

丙型副伤寒沙门氏菌脂多糖提取纯化及活性分析

为了提取、纯化天鹅源丙型副伤寒沙门氏菌脂多糖（LPS）并检测其活性,试验通过热酚水法提取丙型副伤寒沙门氏菌LPS,采用DNaseⅠ、RNase A和蛋白酶K及醇沉法纯化LPS,测定LPS提取物中多糖、蛋白及核酸的含量,鲎试剂检测凝集活性,显色基质法测定其活性。结果显示,纯化的丙型副伤寒沙门氏菌LPS平均产率为1.48%,多糖含量为3.84%,蛋白含量为1.49%,核酸含量为 5.45%,且核酸片段低于100 bp,SDS-PAGE电泳和银染结果显示条带主要集中在10～15 ku范围内,与2 EU/mL鲎试剂的最小凝集浓度是10.99 ng/mL,显色基质法测定其活性为9.82×10⁵ EU/mg。该试验提取、纯化的丙型副伤寒沙门氏菌LPS纯度较高,生物活性良好。     

猪源大肠杆菌脂多糖的提取、纯化及活性分析

为了从猪源大肠杆菌中获得纯度高、产率高的脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）,并评价其毒力,本试验采集仔猪腹泻粪便作为病料,进行细菌分离鉴定和16S rDNA鉴定,采用热酚水法提取细菌的LPS,通过DNaseⅠ、RNaseA、蛋白酶K和醇沉法对LPS进行纯化,通过苯酚硫酸法、Bradford法和紫外分光光度法测定LPS多糖、蛋白及核酸含量,鲎试剂定量法测定其活性,采用小鼠急性毒性试验方法测定小鼠半数致死量（LD₅₀）。结果显示,分离获得一株具有高致病性的猪源大肠杆菌,纯化的猪源大肠杆菌LPS平均产率为3.74%,其中多糖含量为13.40%,蛋白含量为0.48%,核酸含量为0.06%,主要条带集中在14~160 ku范围内,鲎试剂定量法测定其活性为1.21×10⁷ EU/mg,提取LPS对小鼠的LD₅₀为31.86 mg/kg。该猪场仔猪腹泻是由致病性大肠杆菌引起,获得其毒力因子LPS纯度高、产率高、毒力强,这将为临床防制猪大肠杆菌病及LPS提取纯化提供理论依据。     

猪IL-10基因的原核表达纯化及功能鉴定

为进一步研究猪IL-10及其生物活性,本研究将猪IL-10基因克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,并成功获得其重组蛋白。用IPTG诱导重组蛋白表达,通过GST-亲和柱层析对重组蛋白进行纯化,将纯化的重组蛋白处理猪肺泡巨噬细胞,显著抑制PRRSV感染诱导的IL-12表达,将重组蛋白免疫家兔以制备抗血清,然后利用双向琼脂扩散方法、Western Blot试验对抗血清效价、特异性等生物活性进行了检测。结果表明,该抗血清具有较高的抗体效价和很好的特异性,可以作为IL-10特异性抗体用于今后的试验研究。     

谷氨酰胺对急性肺损伤小鼠MUC5AC的调节及其对肺脏的保护作用

旨在探讨谷氨酰胺(GLN)对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤小鼠黏蛋白MUC5AC表达的调节作用及其对肺损伤的保护作用。选用雌性ICR小鼠32只随机分成4组:正常对照组(PBS组)、谷氨酰胺组(GLN)、内毒素组(LPS)、谷氨酰胺+内毒素组(GLN+LPS)。采用气管滴注LPS的方法刺激小鼠建立急性肺损伤(ALI)模型,在滴注LPS12 h后采集肺组织进行湿干重比值,IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8、HSP70、MUC5AC的mRNA水平,IL-6、TNF-α含量以及HSP70、MUC5AC蛋白含量的测定,通过HE染色观察肺组织形态学变化。结果显示:与对照组相比,LPS组MUC5AC、IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA表达量极显著升高,HSP70 mRNA表达量极显著降低;MUC5AC蛋白的表达量极显著增加,HSP70蛋白的表达量极显著降低;IL-6、TNF-α含量极显著升高,肺组织湿干比值极显著增加;肺泡破裂较严重,细支气管黏液分泌增加且可见杯状细胞部分脱落;与LPS组相比,GLN+LPS组IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表达量极显著降低,MUC5AC、IL-8 mRNA表达量显著降低,HSP70 mRNA表达量显著升高;MUC5AC蛋白的表达量显著减少,HSP70蛋白的表达量显著升高,IL-6、TNF-α含量极显著降低;肺组织湿干比值显著减少;部分肺泡破裂,杯状细胞排列整齐,细支气管黏液分泌量减少。结果表明:静脉注射谷氨酰胺能减少LPS诱导的小鼠肺组织中MUC5AC、IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA和MUC5AC蛋白的表达,减少IL-6、TNF-α的含量,增加HSP70 mRNA和HSP70蛋白的表达,减轻肺组织损伤;谷氨酰胺可能通过增加HSP70的表达来对LPS诱导的急性肺损伤小鼠起到保护作用。     

发酵金针菇多糖通过核转录因子-κB-NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3信号通路抑制巨噬细胞炎症反应

为探究金针菇多糖(FVP)和发酵金针菇多糖(FFVP)对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)炎症反应的影响与机制,以脂多糖(LPS)构建RAW264.7炎症模型,设置CON组(正常培养基)、LPS组(正常培养基+1μg/mL LPS)、FVP组(正常培养基+1μg/mL LPS+25、50或100μg/mL FVP)和FFVP组(正常培养基+1μg/mL LPS+25、50或100μg/mL FFVP),通过测定RAW264.7的细胞活力、吞噬能力、活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)含量以及炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量与mRNA相对表达量,比较FVP和FFVP抑制巨噬细胞炎症反应的作用;以核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂BAY11-7082处理RAW264.7,通过Western blot检测磷酸化核转录因子-κB抑制蛋白α(p-IκBα)、NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)、半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)和IL-1β的蛋白相对表达量,探究FVP和FFVP对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应可能的作用机制。结果表明:FVP和FFVP均能抑制LPS引起的RAW264.7 ROS和NO含量升高,浓度为100μg/mL时,两者差异显著(P<0.05);相比LPS组,FVP和FFVP分别使RAW264.7的吞噬能力提升37.65%和47.06%;FVP和FFVP降低炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的含量及mRNA相对表达量,并呈剂量依赖性。Western blot结果表明以BAY11-7082与FVP或FFVP同时处理,RAW264.7的p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),说明FVP/FFVP可通过降低IκBα的磷酸化抑制NLRP3信号通路的激活。综上可知,FVP和FFVP均能增强RAW264.7的细胞活力和吞噬能力,降低ROS和NO含量,通过抑制NF-κB-NLRP3信号通路的激活抑制巨噬细胞炎症反应;相同浓度下,FFVP的抗炎效果优于FVP。     

IL-21对LPS诱导的巨噬细胞中细胞因子IL-1β、IL-10、IL-12 mRNA表达的影响

通过分离并培养BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞,采用SqRT-PCR的方法检测IL-21对LPS诱导的巨噬细胞中细胞因子IL-1β、IL-10、IL-12mRNA表达的影响。结果表明,与NT组相比,单独LPS处理组IL-1β、IL-10、IL-12mRNA表达明显增加,差异极显著;与LPS组相比,在IL-21+LPS组中,IL-21显著抑制LPS诱导的巨噬细胞中IL-1β、IL-10、IL-12mRNA表达,差异显著。以上结果表明,IL-21通过抑制LPS诱导的巨噬细胞中IL-10、IL-12、IL-1β的表达,在固有免疫应答中发挥一定的作用。     

艾叶挥发油对脂多糖诱导的巨噬细胞的抗炎作用

本试验旨在研究艾叶挥发油(AAEO)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞的抗炎作用。以LPS诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)建立炎症模型,设置对照组[添加0.1%二甲基亚砜(DMSO)的培养基]、LPS组(添加1μg/mL LPS的培养基)、不同浓度AAEO组(分别添加5、10、20μg/mL的AAEO,预处理1 h,再添加1μg/mL LPS的培养基),每组设置3个重复孔,培养24 h。结果表明:与对照组相比,LPS组RAW264.7细胞一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量以及TNF-α、IL-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA相对表达量均升高显著(P 0.05)。与LPS组相比,5、10、20μg/mL AAEO组RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-6和MCP-1含量以及IL-6和iNOS mRNA相对表达量均显著降低(P 0.05),10、20μg/mL AAEO组RAW264.7细胞IL-1β含量和IL-1βmRNA相对表达量均显著降低(P 0.05)。由此可见,AAEO可以通过调节细胞炎性因子的mRNA表达以及调控细胞因子和炎症介质的分泌起到缓解LPS诱导巨噬细胞炎症的作用,且存在一定剂量效应关系。AAEO具有一定的抗炎活性。     

西洋参茎叶体外抑制大肠杆菌增殖及抗炎活性的研究

为探讨西洋参茎叶不同提取部位对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7抑菌效果及脂多糖（LPS）诱导的抗炎活性的影响，本试验用106 CFU/mL大肠杆菌菌液侵染RAW264.7细胞，分别以西洋参茎叶水提取和醇提取部位0.125、0.25、0.5 mg/mL作用细胞，CCK-8法检测不同提取物浓度对RAW264.7细胞增殖活性的影响，Hoechst染色法观察细胞被大肠杆菌侵染后的凋亡情况。LPS诱导细胞炎症反应，ELISA法检测细胞炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的释放情况|实时荧光定量PCR法测定细胞中细胞炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达。结果表明：西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位能抑制大肠杆菌诱导的细胞凋亡|西洋参茎叶水提取部位提取物浓度为0.25 mg/mL 时，细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6细胞炎症因子浓度分别降低了50.20%、22.21%、43.41%，对其mRNA基因表达量分别降低了12.31%、27.07%、29.01%|西洋参茎叶醇提取部位提取物浓度为0.25 mg/mL时，细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6细胞炎症因子浓度分别降低了59.70%、 30.24%、52.38%，对其mRNA基因表达量分别降低了21.54%、 29.84%、31.79%，且醇提取部位较水提取部位的抑制效果好。西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位对大肠杆菌有抑制作用，能增强细胞抗炎活性，为西洋参茎叶作为中草药饲料添加剂进一步开发利用提供了理论依据。 [关键词] 西洋参茎叶|中草药饲料添加剂|抑菌|抗炎     

紫花地丁总黄酮体外抗炎活性研究

试验研究了紫花地丁总黄酮（TFV）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞活力、细胞中炎症介质含量以及相关基因表达的影响,以期探讨其体外抗炎活性的作用。试验采用MTT法筛选出TFV对小鼠RAW264.7巨噬细胞活力具有促进作用的最佳添加浓度;用酶联免疫吸附法（ELISA）检测了TFV对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞释放到细胞培养液中NO、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）含量的影响;运用实时荧光定量PCR法检测了TFV对LPS诱导的炎性小鼠RAW264.7巨噬细胞TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶2（COX-2）相对表达水平的影响;研究并分析了TFV的体外抗炎活性。试验结果表明,TFV在5~50 μg/mL浓度范围内能提高小鼠RAW264.7巨噬细胞的活力（P<0.05）;与LPS模型组比较,TFV能显著降低LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞产生NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量,并能显著降低LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞内TNF-α、COX-2等炎症因子的mRNA表达量（P<0.05）。综上,TFV能显著下调LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子的释放量和下调TNF-α、COX-2 mRNA的表达量,说明抑制促炎性细胞因子基因的表达可能是实现其抗炎作用的原因之一。     

紫花地丁总黄酮体外抗炎活性研究

试验研究了紫花地丁总黄酮(TFV)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞活力、细胞中炎症介质含量以及相关基因表达的影响,以期探讨其体外抗炎活性的作用。试验采用MTT法筛选出TFV对小鼠RAW264.7巨噬细胞活力具有促进作用的最佳添加浓度;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了TFV对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞释放到细胞培养液中NO、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)含量的影响;运用实时荧光定量PCR法检测了TFV对LPS诱导的炎性小鼠RAW264.7巨噬细胞TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)相对表达水平的影响;研究并分析了TFV的体外抗炎活性。试验结果表明,TFV在5～50μg/mL浓度范围内能提高小鼠RAW264.7巨噬细胞的活力(P0.05);与LPS模型组比较,TFV能显著降低LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞产生NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量,并能显著降低LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞内TNF-α、COX-2等炎症因子的mRNA表达量(P0.05)。综上,TFV能显著下调LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子的释放量和下调TNF-α、COX-2 mRNA的表达量,说明抑制促炎性细胞因子基因的表达可能是实现其抗炎作用的原因之一。     

穿王消炎粉对LPS诱导大鼠急性肺损伤的治疗作用

【目的】 研究穿王消炎粉对脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)的治疗作用。【方法】 将60只SD雄性大鼠随机分入空白组、左氧氟沙星阳性药物对照组、LPS模型组及穿王消炎粉低(1 g/kg体重)、中(2 g/kg体重)、高(4 g/kg体重)剂量组,每组10只。模型组和给药组大鼠经滴鼻法给予LPS(3 mg/kg体重)制备大鼠ALI模型,24 h后,给药组分别灌胃相应浓度的穿王消炎粉,模型组和空白组灌胃相同体积的生理盐水。治疗4 d后处死大鼠,分离血清、固定并冻存肺脏组织。测定各组大鼠肺脏组织湿/干重比;HE染色观察大鼠肺脏组织病理学变化;ELISA法检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6含量;采用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达水平和蛋白表达量。【结果】 与空白组相比,LPS模型组大鼠出现肺间质壁增厚,肺泡腔内炎性细胞浸润、出血,肺泡结构破坏等肺损伤症状,肺组织的湿/干重比极显著升高(P<0.01),血清中IL-1β、IL-6含量和肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达水平及蛋白表达量均显著增加(P<0.05)。与LPS模型组相比,各给药组大鼠肺间质增宽现象有所改善,肺组织的湿/干重比、血清和肺脏组织中炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA表达水平及蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。【结论】 穿王消炎粉可有效抑制LPS诱导的急性肺部损伤和炎症程度。     

连翘酯苷A对内毒素致鸡脾淋巴细胞白介素-1β的影响

试验旨在研究内毒素和连翘酯苷A对鸡脾淋巴细胞中白介素-1β(IL-1β)水平的影响,将1日龄雏鸡常规饲养至50日龄时,心脏采血处死后,无菌剖检取脾,并用鸡脾淋巴细胞分离液将鸡脾淋巴细胞分为20个组,具体为5个时间点×4个剂量组=20个组。作用时间分别为0、6、12、24和48 h,作用剂量组分别为对照组、内毒素(LPS)组(5μg/m L)、连翘酯苷A预防低剂量组(5μg/m L LPS+200μg/m L连翘酯苷A)和连翘酯苷A预防高剂量组(5μg/m L LPS+400μg/m L连翘酯苷A)。按上述方法培养后,收集鸡脾淋巴细胞,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测鸡脾淋巴细胞中IL-1β水平。ELISA结果显示:与对照组相比,LPS组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量下降,并与连翘酯苷A添加剂量呈正相关。qRT-PCR结果显示:与对照组相比,LPS组鸡脾淋巴细胞中IL-1βmRNA表达量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1βmRNA表达量下降,并呈剂量时间效应。试验表明LPS可以诱导鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量升高,而连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量下降,表明连翘酯苷A可以通过转录和翻译途径抑制LPS诱导的鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量的升高,减轻炎症反应,发挥抗炎功能。     

褪黑素对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的缓解作用

本试验旨在探讨褪黑素(MT)对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)炎症反应的缓解作用及潜在机制。利用不同浓度(0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μg/mL)的LPS处理BMECs 6和12 h后,通过测定BMECs活性和炎性细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)]含量,确定10μg/mL的LPS诱导12 h用于正式试验。正式试验共设7组,每组设4个重复。对照组BMECs不进行LPS诱导和MT处理,LPS组BMECs进行LPS诱导12 h,LPS+MT组BMECs进行LPS诱导12 h后再经不同浓度(1、5、10、50和100μmol/L)MT处理48 h。结果表明:1)与对照组相比,LPS组BMECs中TNF-α含量升高(P 0.05), BMECs中IL-6和IL-1β含量显著升高(P 0.05)。与LPS组相比,10和50μmol/L MT组BMECs中TNF-α含量显著降低(P 0.05),1、5、10和100μmol/L MT组BMECs中IL-6含量显著降低(P0.05),10μmol/L MT组BMECs中IL-1β含量显著降低(P0.05)。2)与对照组相比,LPS组BMECs中Toll样受体4(TLR4)蛋白表达量升高(P0.05),BMECs中核因子-κB同源蛋白(P65)和核因子-κB抑制蛋白-α(IκB-α)蛋白表达量显著降低(P0.05)。与LPS组相比,50和100μmol/L MT组BMECs中TLR4蛋白表达量显著降低(P0.05),1、10和50μmol/L MT组BMECs中P65蛋白表达量显著或极显著升高(P0.05或P0.01),1、5、10和50μmol/L MT组BMECs中IκB-α蛋白表达量显著或极显著升高(P0.05或P0.01)。由此可见,MT能够降低LPS诱导的BMECs中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,调控LPS诱导的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表达量,MT可能通过参与核因子-κB炎症通路缓解LPS诱导的BMECs炎症反应。     

GPX4失活通过JNK通路缓解LPS诱导巨噬细胞炎症反应

【目的】 研究硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidases 4,GPX4）失活如何参与调控脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应及其潜在的分子机制。【方法】 体外培养RAW264.7巨噬细胞,以DMSO为对照,使用0.1~5.0 μmol/L GPX4抑制剂FIN56处理,通过CCK-8法检测细胞活力和Western blotting检测GPX4蛋白表达水平,确定抑制剂最适浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为4组：对照组,添加DMSO培养24 h;FIN56（GPX4抑制剂）组,添加0.5 μmol/L FIN56培养24 h;DMSO-LPS组,DMSO培养24 h后使用LPS （100 ng/mL）刺激3 h;FIN56-LPS组,FIN56培养24 h后使用LPS刺激3 h。各组细胞经培养后,利用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,H₂DCFDA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,使用试剂盒法检测细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平,分别使用ELISA和荧光定量PCR检测促炎细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌水平和基因表达量,使用Western blotting法检测Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）信号通路相关蛋白表达水平。【结果】 与DMSO处理相比,0.5 μmol/L FIN56处理巨噬细胞24 h对细胞活性无显著影响（P>0.05）,且显著降低GPX4蛋白表达水平（P<0.05）,故选用0.5 μmol/L FIN56用于后续实验。与对照组相比,FIN56和LPS均显著增加了ROS积累（P<0.05）,而与DMSO-LPS组相比,FIN56-LPS组ROS水平显著升高（P<0.05）。与对照组相比,LPS可显著增加小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量和IL-6含量,以及c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase,JNK）和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,而FIN56可显著下调LPS诱导的IL-6的mRNA表达量和含量及JNK和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,但对p38蛋白（p38 MAPK,p38）、细胞外调节蛋白激酶（phosphorylate extracellular regulated protein kinases1/2,Erk1/2）蛋白表达水平无显著影响（P>0.05）。【结论】 GPX4失活可有效阻断JNK和c-Jun磷酸化,从而特异性抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。该结果可为以GPX4为靶点研发抗炎治疗策略提供理论依据。     

绵羊肺炎支原体及其脂质相关膜蛋白诱导绵羊肺泡巨噬细胞IL-1β表达的分子机制

为证明TLR2是否参与绵羊肺炎支原体(Mo)或LAMPs刺激肺泡巨噬细胞时细胞因子的表达,使用Mo或LAMPs刺激绵羊肺泡巨噬细胞后,利用荧光定量PCR、流式细胞术、Western blot以及ELISA等方法分别对TLR2转录和翻译水平、MAPK信号通路激活情况和IL-1β分泌情况进行检测。同时,使用TLR2抑制抗体及MAPK抑制剂后,利用荧光定量PCR、Western blot以及ELISA检测MAPK信号通路激活情况和IL-1β分泌情况。结果显示,绵羊肺泡巨噬细胞受Mo或LAMPs刺激后,TLR2在基因和蛋白表达水平均有不同程度上升,MAPK信号通路中各信号蛋白均发生磷酸化反应,IL-1β在基因和蛋白表达水平均有不同程度上升。对TLR2及MAPK功能抑制后,MAPK信号通路的激活及IL-1β的表达均受到明显抑制。结果提示,Mo及其LAMPs可通过绵羊肺泡巨噬细胞的TLR2受体激活MAPK信号通路,继而引起细胞因子IL-1β的分泌增多。