濒危药用植物沙冬青内生真菌分离及其抑菌活性初步研究

为探明濒危药用植物沙冬青内生真菌资源的多样性及其抑菌活性特征,通过组织块法对内生真菌进行了分离,并选择小麦全蚀病菌、枸杞黑果病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。结果显示,从沙冬青不同组织器官中分离出41株内生真菌,根部最多,其次为叶部,茎部最少,经形态学初步分类鉴定归于5个目,6个科,19个属;有31株菌对2种或多种指示菌有不同程度的抑制作用,占菌株总数的75.6%,15株内生真菌对1种或多种供试细菌指示菌具有不同程度的抑制作用,占分离菌株总数的36.6%,其中5株内生真菌分别对4种植物病原真菌指示菌具有明显的抑制作用,占菌株总数的12.2%,8株内生真菌对1种供试细菌指示菌有明显的抑制作用,占分离菌株总数的19.5%, 4株内生真菌菌株即对供试植物病原真菌指示菌又对供试细菌指示菌有明显抑制作用, 抑菌范围宽,属于青霉属、束丝菌属、茎叶核菌属。濒危药用植物沙冬青具有丰富的内生真菌资源,其开发和利用具有重要的生态学意义和经济价值。     

大兴安岭凋落物中可培养真菌分离、鉴定及活性筛选

本研究旨在森林凋落物中尝试分离与鉴定具有抗菌与抗氧化活性的真菌资源。以大兴安岭森林凋落物为材料,利用稀释涂布平板法分离凋落物真菌,通过内部转录间隔区序列(ITS)进行真菌鉴定,利用平板打孔药剂扩散法测试抗菌活性,通过TLC-DPPH法进行提取物的抗氧化活性测定。本研究共分离得到65株真菌,它们分别隶属于47个属,54个分类单元,其中有16株真菌的序列相似性≤98%。这16株真菌中有8株有抗细菌活性,有10株有抗真菌活性,有6株菌的粗提物有抗氧化活性。发现3株真菌同时具有抗菌、抗氧化活性,它们最相近菌属分别为Phaeosphaeria、Cephalosporium和Ophiobolus。大兴安岭真菌资源丰富,本研究为抗菌及抗氧化的真菌天然资源的开发,提供了基础数据与备选菌株。     

2株放线菌的抗菌活性及分类学地位

旨在对2株放线菌HD-103和HD-109的抗菌活性和发酵液稳定性进行比较分析,并明确2株菌的分类学地位。以13种植物病原真菌为靶标菌,利用琼脂柱法分析2株生防菌的抗菌谱;以尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.glycines)为指示菌,利用杯碟法检测2株生防菌发酵液的热稳定性、pH稳定性及紫外稳定性,并进行比较分析;在此基础上采用多相分类法对2株菌进行鉴定。研究结果显示：2株菌的抗真菌谱均较广,其中HD-103对禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearumf.sp.Glycines)的抑制效果最显著,抑菌圈直径达到23.7mm,HD-109对烟草赤星病菌(Alternariaalternate)抑制效果最好,抑菌圈直径达25.0mm;HD-103的抗菌活性物质较HD-109的活性物质更为稳定;分类学鉴定结果表明,菌株HD-103与HD-109为微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)的2个菌株。菌株HD-103与HD-109能够抑制多种植物病原真菌,其发酵液具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,具有开发为新型生物农药的潜力。     

芽孢杆菌E-1的鉴定及其抑菌活性

从云南昆明市郊不同地点紫茎泽兰根际分离细菌,经平板对峙培养筛选出一株抑菌能力较强的菌株,命名为E-1。通过菌株的培养性状、常规生理生化特性和16S rDNA序列测定及其系统发育学分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册,登录号为JN648100。对E-1与供试的5株植物病原细菌和5株病原真菌进行对峙试验。结果显示：E-1对土传病原细菌和真菌都有不同程度的拮抗作用,是较好开发潜能的生防菌株。     

生防菌株NJ-18的鉴定及其对几种植物病原真菌的拮抗作用研究

NJ-18是从油菜田土壤中分离筛选获得的一株具有抗真菌活性的细菌,本研究从形态和生理生化特征及16S rDNA序列分析,鉴定NJ-18菌株为枯草芽孢杆菌。经平板对峙试验表明,NJ-18发酵液对Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solani、 Fusarium moniliforme、Magnaporthe grisea、F. graminearum、R. cerealis、 Alternaria solani、Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum等九种植物病原真菌菌丝生长都具有良好的广谱抑菌活性;盆栽植株试验表明,NJ-18发酵液对小麦白粉病具有很好的保护和治疗作用,发酵原液的保护和治疗作用效果分别高达到96.1%和88.2%,发酵液稀释200倍后处理,对小麦白粉病的保护和治疗作用效果分别达到58.8%和51.4%。     

土壤栽培中的二律背反与其解决

土壤中细菌、微生物分为两大类:一类是有利于土壤有机质矿化和腐殖质化的有益的细菌、真菌、微生物,如亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫杆菌属等;另一类是有害于植物正常生长、发育的细菌、真菌、微生物和各种病原菌、病毒。土壤栽培中,植物只有依靠各种有益的细菌、微物物将有机质转化为无机矿质营养,才能吸收利用。如有机质在有益细菌作用下转化为无机态氮;土壤中有机质可增加磷的有效性,在微生物作用下逐渐分解(矿化)为无机磷化合物,供植物吸收(或有机质经细菌分     

湖水中低温菌的筛选及其产酶特性

为了探索湖水中低温微生物及其酶活的多样性,并获得具有应用价值的低温菌。以低温环境下湖水为样品,通过平板涂布法和划线分离法对其进行初步分离纯化,进一步进行菌落形态、微观形态观察以及生理生化性质的测定,筛选出能够在低温下生长的菌株。并进行蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、木质素酶功能的测定。结果显示共筛选出可培养的低温微生物22 株,包括细菌14 株,真菌5 株,放线菌3株。7 株具有蛋白酶活性,3 株具有淀粉酶活性,6 株具有木质素酶活性,6 株具有纤维素酶活性。其中WF-1 具有四种酶活性,WB-8 具有三种酶活性,其他菌株具有一种或者两种酶活力。筛选的低温菌株具有多种酶活性,具有潜在的开发价值。     

产广谱抗菌物质芽孢杆菌的筛选与鉴定

旨在筛选出对果蔬病原菌具有广谱拮抗作用的芽孢杆菌。以9株病原真菌和3株病原细菌为指示菌,采用琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,筛选得到一株具有广谱抑菌作用的拮抗芽孢杆菌NCPSJ7。结合形态学、生理生化和16S rDNA序列同源性分析等手段,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus Amyloliquefaciens)。抑菌谱实验表明,解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7对果蔬病原真菌和病原细菌都具有较强的抑菌能力。该菌株产抗菌物质的适宜发酵培养基、发酵条件优化,抗菌物质的分离纯化、组成、性质和抗菌稳定性等还有待于进一步研究。     

艾纳香内生真菌抗细菌和炭疽菌的活性研究

为获得丰富的艾纳香内生真菌资源,筛选出抗性生防菌株,用于活性次生代谢产物的发现,通过水琼脂法对海南产艾纳香进行内生真菌分离,通过ITS序列分析,对其进行鉴定和分析。采用滤纸片法评价内生真菌发酵产物对细菌的抑制活性,采用平板对峙培养法评价艾纳香内生真菌对植物炭疽菌的拮抗作用。本研究共分离鉴定出191株内生真菌,分属于27属,45种,其中优势菌属为Diaporthe、Paraphoma、Ectophoma、Penicillium、Talaromyces、Hypoxylon、Phomopsis、Colletotrichum和Fusarium。抗细菌活性结果显示,Clonostachys、Fusarium和Diapothe属活性较强。抗炭疽病菌试验显示,Talaromyces、Ectophoma和Penicillium属活性较强。本研究初步探讨了海南产艾纳香内生真菌种类的多样性,并首次对其进行了抗病原菌活性筛查,获得的活性菌株可作为微生物源菌剂开发的重要材料。     

大兴安岭森林凋落物真菌及其次生代谢物活性研究

研究旨在得到大兴安岭森林凋落物中具有活性的新型真菌资源。用颗粒法分离森林凋落物中的可培养真菌。用真菌的内部转录间隔区序列对分离到的真菌进行分子生物学鉴定。两种方法被用来对新型真菌进行发酵与次生代谢物粗提物的制备。通过双层平板药剂扩散法与薄层层析清除DPPH自由基法分别测试粗提物的活性。分子鉴定结果表明分离培养了40株凋落物真菌,它们隶属于35个属,38个分类单元,其中6株真菌为疑似真菌新种。来自2株真菌的2个提取物展现了抗细菌活性。尤其是Parapyenchaeta属新种LB0026号菌株具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性,对供试革兰氏阴性细菌未展现明显活性。另外还有2株真菌的2个提取物展现了清除DPPH自由基活性。这2个提取物分别含有2个和3个抗氧化化合物。大兴安岭森林凋落物中,可培养真菌种类丰富,其中有4株新型真菌具有明显的抗菌活性或抗氧化活性,值得深入研究。     

除虫菊内生拟盘多毛孢Y1菌株发酵产物抑菌活性初步研究

摘　要:在对从除虫菊中分离到的内生真菌进行抑菌活性系统筛选的基础上,对其中活性较高的Y1 （Pestalotiopsis sp.）菌株进行了抑菌活性测定。其发酵液10倍稀释液和菌丝丙酮提取物对玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum等 6种供试植物病原真菌菌丝生长的抑制率分别在85. 2%～95.1%之间和40%～80%之间,其 5倍稀释液对番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea和苹果炭疽病菌 Glomerella cingulata孢子萌发的抑制率均大于 82%。活体生测结果表明,该发酵液对番茄灰霉病,辣椒疫霉病和黄瓜霜霉病的保护效果大于 55%,治疗效果不明显。     

芽孢杆菌Pb-4菌株鉴定及其抑菌活性的研究

拮抗菌Pb-4是一株对多种植物病原菌有较强抑制作用的菌株。为了明确拮抗菌Pb-4的分类地位和抑菌机理,通过形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性比对及系统发育树分析,对Pb-4菌株进行鉴定。并采用平板对峙培养法测定Pb-4菌株的抑菌谱,显微观察其抑菌作用,采用硫酸铵沉淀和乙醚、苯提取得到抑菌活性物。通过加热处理,明确高温对Pb-4菌株抑菌活性的影响。结果表明,Pb-4菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌;Pb-4菌株对番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、苹果腐烂病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有广谱性。该菌菌液能明显抑制枯萎病菌孢子的萌发,并对病菌菌丝有致畸作用;对番茄枯萎病菌的抑制生长率达93%,经100,121℃高温处理后的抑菌活性分别是未处理菌液的98.9%和80.1%。从菌液中提取的蛋白、酶、抗生素类活性物质对枯萎病菌的生长繁殖均有很强的抑制效果。为Pb-4菌株在病原菌防治中的广泛应用提供强有力的理论依据。     

生防菌BH-2发酵液中抑菌成分的定位及提取研究

为了明确生防菌BH-2发酵液中的抑菌成分及其提取方法，采用管碟法，通过抑菌活性的测定，对其发酵液中抑菌物质及其提取进行了研究。结果表明，生防菌BH-2发酵液中的抑菌作用大致分为活体的抑菌作用和和代谢活性物抑菌作用，且胞外的抗菌代谢物有较好的热稳定性，而胞内不产生抑菌物质。此外，有机溶剂的萃取试验表明，代谢活性物质的极性较强；不同浓度的硫酸铵和乙醇均不能使其沉淀；酸沉淀法基本上可以将其提取出来。这为该菌株的进一步研究和产品开发提供了理论依据和技术支持。     

一株好氧反硝化细菌的筛选及对土壤脱氮效果研究

为了探究反硝化生物菌剂于盐渍化土壤修复的应用机制和条件,以好氧反硝化能力为主要指标,以宁波慈溪地区的大棚种植土壤为样本,通过筛选比较进行菌株分离,得到一株高效好氧反硝化菌DPT001。通过形态、生理生化特征和16SDNA基因序列分析对菌种进行了菌属鉴定,并研究了该菌株适宜的生长条件。筛分出的好氧反硝化菌为革兰氏阳性短杆菌,属于克伯氏菌属的Castellaniella脱氮杆菌。在好氧环境下,52 h时NO3-降解率达到92%。菌株的适宜生长条件为中性或弱碱性土壤,盆栽试验表明,以此菌剂制备的生物菌肥（培养的菌种和腐熟花生壳混合）对土壤总盐度和硝酸盐浓度都有明显的降低作用。本研究从大棚土中筛选出的好氧反硝化菌,具有较高的反硝化特性,并优于市售的商品脱氮生物菌剂。     

苹果树内生细菌G23的鉴定及其抑菌活性的研究

从苹果树木质部中分离到1株内生拮抗细菌G23,为明确其分类地位及抑菌活性,采用形态学、生理生化测定及16S rDNA序列分析对其分类地位进行鉴定,并对其发酵液进行过滤及高温处理,分析其抗菌物质类型。研究结果表明：该菌株为1株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌株发酵滤液对所测8种病原真菌的抑制率在63.4%~87.5%之间,发酵液经高温处理后活性降低,对8种病原菌的抑制率在57.4%~79.6%,因此推测该菌株可能分泌多种拮抗物质,包括对热不敏感的抗生素类,也包括对高温敏感的肽类及蛋白酶类。     

裂蹄木层孔菌发酵产物抑菌活性的研究

为了研究裂蹄木层孔菌发酵产物对植物病原菌的抑菌活性。采用菌丝生长速率法测定裂蹄木层孔菌不同发酵时间的产物对7种供试病原菌的抑制作用,将裂蹄木层孔菌的发酵产物进行不同的处理,分级纯化抑菌活性多糖,比较其抑菌活性。结果表明：裂蹄木层孔菌发酵产物对7种病原菌均有抑制作用;发酵时间为20天的裂蹄木层孔菌发酵产物对杨树烂皮病的抑制率最高;裂蹄木层孔菌发酵产物的主要抑菌活性物质存在于发酵上清液醇提物中;醇沉级别为30%（浓度为50 mg/mL）醇提物中的多糖对病原菌的抑制率为供试醇沉级别中最高。说明裂蹄木层孔菌含有抑制病原菌的有效成分,具备成为新型生物农药的潜力。     

棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1的分离鉴定及其防病作用

为研制和开发新疆棉花黄萎病优良生防菌剂,采用琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,分离得到一株对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)具有较强抑菌活性的拮抗菌株TUBP1。通过对形态观察、生理生化实验、16S rDNA和gyrB的基因序列分析,确定该菌株为Bacillus axarquiensis;利用生长速率法和牛津杯法分别测定了发酵液对棉花黄萎病菌抑菌活性,对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制率为78.62%±3.48%,抑菌圈直径为21.00±3.86 mm。温室盆栽试验中,TUBP1最大生防效果为43.67%,小区试验中,TUBP1最大生防效果为43.07%。     

枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质条件的优化

为明确枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质的最佳条件,提高其抗菌活性物质的产量,以发酵液抑制油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)活性为指标,在摇瓶条件下采用单因素和正交实验对该菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行了优化。结果表明,菌株RSS-1产生抗菌物质的最佳培养基组分比例为2.0%的玉米淀粉,1.5%的蛋白胨,0.05%的MgSO_4;最佳发酵条件为培养基初始pH 6.0,培养温度为28℃,培养时间为5天,100 mL三角瓶装液量25 mL,接种量为0.1%,转速为180 r/min。优化后的枯草芽孢杆菌RSS-1菌株的无菌培养滤液对油菜菌核病菌的抑菌活性显著增强。     

响应面法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7产抗菌蛋白条件的优化

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7是从发病棉田土壤中分离得到的1株生防细菌,其对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.V190具有明显的拮抗作用,已证明其抗菌物质为蛋白质。采用响应面法对该生防菌株的产抗菌蛋白条件进行优化,以期为棉花黄萎病生物农药的研制开发以及抗菌蛋白的后续研究奠定基础。以发酵液上清液对大丽轮枝菌的抑菌圈面积为考察指标,首先采用单因子试验考察培养时间、温度、初始pH、碳源、氮源、无机盐等因素对菌株12-7发酵产抗菌蛋白的影响;再根据响应面分析法的基本原理和方法,对发酵条件进行优化。得出该菌株产抗菌蛋白的最优发酵培养基和培养条件为:1.5%(质量分数)蔗糖、1.5%(质量分数)大豆蛋白胨、0.3%(质量分数)NaCl、0.1%(质量分数)K2HPO4、初始p H7.3的培养基,31℃发酵培养60 h。优化后抑菌圈面积从试验设计初期的171.95 mm2提高至320.3 mm2,且经过验证试验证实预测值与实际值之间具有较好的拟合度。