陆地棉×亚洲棉胚胎在培养条件下的发育研究

离体培养陆地棉与亚洲棉杂种胚珠,并以陆地棉自交为对照。观察结果表明,杂种胚胎表现出明显的生长优势,能顺利地通过胚胎发育的各个时期而达成熟胚。其原因是,胚乳游离核迅速解体,珠心组织也随之解体,而不形成胚乳细胞并使胚囊腔迅速扩展,使杂种胚有足够的营养源,并提供了足够的生长空间。自交胚胎的生育速度远不及杂种胚,发育受抑,尤其是球形胚到心形胚的时期较长。     

百蕊草体细胞胚的分化及其内源生长调节物质的变化特性

【目的】探明百蕊草体细胞胚发生过程中的组织细胞特征及内源生长调节物质的变化规律,为建立百蕊草体细胞胚组培苗快繁技术体系提供理论参考,并为丰富百蕊草细胞分化和器官形态建成等基础理论提供基础信息。【方法】采用显微观察方法对叶片外植体诱导的百蕊草愈伤组织及不同分化培养时期的体细胞胚进行组织细胞学观察,并检测不同分化时期的体细胞胚内源激素和类似物含量、抗氧化酶活性及可溶性蛋白质含量。【结果】胚性和非胚性愈伤组织的形态和细胞结构差异明显。体细胞胚分化经历的时期有多细胞原胚(PM)、球形胚(GE)、心形胚(HE)、鱼雷形胚(TE)和子叶胚(CE)等。内源激素及类似物中反式玉米素(tZT)含量与玉米素核苷(ZR)和吲哚-3-乙酸(IAA)含量呈显著正相关(r=0.421^*,r=0.536^*),与脱落酸(ABA)含量呈极显著负相关(r=-0.688^**),tZT与IAA、ZR对百蕊草体细胞胚发生的作用相同。ABA含量与IAA和ZR含量呈显著负相关(r=-0.401^*,r=-0.430^*)。赤霉...     

东方百合杂交种胚囊发育与双受精过程细胞学观察

以东方百合索蚌(Sorbonne)和元帅(Acapulca)为试材,采用石蜡切片法和荧光显微技术研究其胚囊发育,观察花粉管生长和双受精过程,研究适合百合的授粉及进行胚抢救的时期.结果表明:百合大孢子的发育形式为贝母型,其胚囊发育最终形成育性正常的7细胞胚囊,-2级的胚囊已经发育成熟,适宜授粉受精.异花授粉后花粉管3～5d到达胚囊,并释放出2个精核进行双受精.百合胚胎发育经过合子、原胚、球形胚、子叶型最终发育成熟.胚乳发育与胚胎同步,属于核型胚乳,在形成球形胚后胚乳细胞逐渐形成细胞壁.授粉后45d进行胚抢救较好.     

桂花胚和胚乳发育过程的研究

采用石蜡切片法，观察了桂花胚和胚乳的发育过程。结果表明，桂花胚胎发生类型为柳叶菜型。其卵细胞受精后，合子经过一段时间休眠，于10月中，下旬才进行第1次分裂，合子分裂通常发生在初生胚乳核分裂之后，合子经棒形胚，球形胚，心形胚，至果实成熟时发育为鱼雷胚。心形胚时期，胚柄最为发达。桂花的胚乳发育类型为细胞型。二核胚囊时，珠被内层特化为珠被绒毡层，球形胚时，珠被绒毡层细胞发生形变，最后构成种皮的最内层。     

菊花脑大孢子发生、雌配子体与胚胎发育的研究

利用常规石蜡制片、组织压片以及显微观察技术对菊属植物菊花脑(Dendranthema nankingense)大孢子发生、雌配子体及胚胎发育过程进行了研究。研究发现,雌蕊具有单子房、单胚珠、二裂状柱头,胚珠为倒生型;大孢子母细胞经过减数分裂形成线形排列的4个大孢子,其中珠孔端大孢子为功能大孢子,能够进一步发育成单核胚囊,而合点端的3个大孢子在发育过程中逐渐解体;胚囊发育为单孢子待宵草型,单核胚囊经过两次连续分裂,形成四核成熟胚囊,成熟胚囊珠孔端有2个助细胞和1个卵细胞,胚囊中央有1个单核中央细胞;胚胎发育过程可分为球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚4个阶段;雌配子体和胚胎在发育过程中,败育频率分别高达46%和75%以上。结果表明,菊花脑功能大孢子位于珠孔端和胚囊发育属于单孢子待宵草型是区别于大多数被子植物的重要生殖特征;雌配子体和胚胎发育过程中的大量败育现象可能是菊花脑与栽培菊花种间杂交结实率低的一个重要原因。     

红丁香引种栽培条件下种子败育的解剖学研究

为确定红丁香在北京城区引种栽培条件下种子败育发生的时期,对其有性生殖过程进行了形态和胚胎发育解剖观察。授粉试验显示,北京市植物园引种栽培的红丁香人工自花授粉及去雄套袋授粉均未坐果,人工异花授粉坐果率为31.86%,天然授粉坐果率为8.32%,表明栽培条件下红丁香自交不育,传粉媒介不足导致坐果率低,但是各种授粉方式均未获得种子。胚胎发育过程解剖观察显示:红丁香花药壁发育为基本型,腺质绒毡层,胞质分裂为同时型,2-细胞成熟花粉;倒生胚珠,单珠被,薄珠心,胚囊发育为蓼型,核型胚乳,胚发育类型为紫菀型,先后形成球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚;但后期子叶胚发育停滞,其细胞逐渐降解,随后胚乳细胞也出现降解。可见,栽培条件下红丁香大小孢子及雌雄配子体发育、传粉受精过程、胚胎发育初期均正常,但后期胚、胚乳均发育停止,是红丁香引种栽培条件下种子败育的关键环节,其原因有待进一步研究。      

甘蓝型油菜胚胎发育的观察

本文对甘蓝型油菜小塔品种的胚胎发育,作了较系统的观察,要点如下:1.胚囊的发育属蓼型;配子融合属有丝分裂前型;胚乳的形成属核型;胚胎发生属十字花型。2.在成熟胚囊中,助细胞的丝状器很显著,卵细胞及合子的极性明显,两个极核也很显著。3.在授粉后18-24小时,卵细胞开始受精,在授粉后54-58小时,合子开始分裂,但初生胚乳核则在授粉后32小时已开始分裂。4.从合子开始分裂到形成8分体原胚,为线形胚时期,以后胚体逐渐膨大,直到多细胞球形胚时期,为辐射对称器官分化之前,属于原胚阶段。5.由球形胚进一步分化为心形胚、鱼雷形胚、手杖形胚到马蹄形胚,为胚体两侧对称的分化阶段。6.胚乳游离核在胚囊内作彩带状分布外,密集于珠孔区,围绕着原胚,及密集于合点区,形成游离核群,在心形胚时期,游离核开始形成胚乳细胞。7.少数胚珠在原胚时期由胚柄细胞分裂形成裂生多胚现象,平均出现频率为2.49%。     

枇杷胚胎发生的观察

采用石蜡切片法、超薄切片法和胚囊酶法分离技术。观察了“梅花霞”等枇杷品种的胚胎发生.枇杷柱头的中央有传递细胞,胚珠的外珠被细胞和内珠被细胞结构明显不同.胚囊属蓼型胚囊,胚囊内有典型的卵器。受精卵发育为原胚,经历球形、心形、鱼雷形期后,成为成熟胚,核型胚乳于心形胚时形成细胞壁,文中还就一些胚胎学问题作了简要的讨论.     

烟草早期胚胎细胞观察方法研究

【目的】分析整体透明法和酶解分离法在烟草早期胚胎观察中的应用效果,为烟草细胞发育研究提供参考。【方法】分别采用整体透明法和酶解分离法对烟草早期胚胎细胞进行连续观察,分析两种方法的优缺点。【结果】采用整体透明法观察烟草胚胎,均可清晰观察到烟草的2-细胞原胚、4-细胞原胚至未分化的球形胚,而观察的早期球形胚基部胚柄不够清晰,且后期发育的胚胎不易观察。酶解分离法能够观察到烟草整个发育阶段的胚胎,即烟草2-细胞原胚、开始分化的球形胚、心形胚;但经二次酶解分离,从2-细胞原胚到16-细胞早期球形胚时期的胚胎细胞均存在质壁分离现象,而晚期胚胎未出现此现象。整体透明法具有操作简便、所需材料较少、具有原位地形学观察等优点,能够保持胚胎组织的原位性。酶解分离法耗时较短,但其胚胎细胞缺乏原位性,部分存在质壁分离现象,可获得独立的不包含母体组织的胚胎细胞。【结论】在烟草胚胎发育时期,可根据对不同时期胚胎研究的需要,合理选择适宜的观察方法;或结合整体透明观察法与酶解分离法对早期胚胎进行观察,提高烟草胚胎发生的连续观察效果。     

2苹果品种叶片胚状体再生体系的建立

以苹果“富士”和“鲁加6号”为材料,建立叶片胚状体再生体系。结果表明:先经胚性细胞诱导培养基MS+BA1.0 mg·L^-1+NAA5.0 mg·L^-1+TDZ0.5 mg·L^-1诱导胚性细胞,再置于胚胎发育培养基MS+BA1.0 mg·L^-1+NAA0.1 mg·L^-1上进行暗培养,最佳时间为10 d,2品种叶片再生率分别为96.7%和100%。经胚状体不同时期形态学组织学观察,显示胚状体发育时期经历原胚、球形胚、心形胚、子叶形胚、鱼雷形胚、成熟胚等阶段。“鲁加六号”苹果最佳生根培养基为1/2MS+IAA0.1 mg·L^-1+IBA0.1 mg·L^-1,生根率达86.7%。     

GSH和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究活性氧(ROS)-过氧化氢和抗氧化剂-还原型谷胱甘肽(GSH)对小鼠2-细胞期胚胎体外发育的影响.用含有不同浓度H2O2的mSOF液培养小鼠胚胎,从H2O2浓度0.14 mg/L组开始的囊胚发育率显著低于对照组和其它组(P0.05);以mSOF液为基础液,在添加0.14 mg/L H2O2的基础上分别添加不同浓度的GSH,阳性对照组的囊胚发育率显著高于阴性对照组(P0.05);在添加外源性H2O2(0.14 mg/L)的情况下,随着GSH浓度的增加其囊胚发育率也显著增加.结果表明,H2O2可诱导小鼠2-细胞期胚胎体外发育的阻滞,GSH可阻止H2O2对小鼠2-细胞期胚胎的抑制效果.     

三-(2,3-二溴丙基)异氰脲酸酯对斑马鱼胚胎发育的毒性研究

为了探究三-(2,3-二溴丙基)异氰脲酸酯(TBC)这一新型含溴阻燃剂对斑马鱼胚胎的毒性效应及潜在的致毒机制,将受精后2h内的斑马鱼胚胎分别暴露于0.2、1、5、25μg/mL的TBC和0.1、0.5、2.5、12.5μg/mL的17β-雌二醇(E2)以及各浓度TBC+2.5μg/mL E2中,分别在24、48、72、120hpf对胚胎进行形态学观察并统计。发现TBC对斑马鱼胚胎72hpf孵化率的抑制作用及120hpf致畸作用呈剂量效应关系,对120hpf胚胎的致死作用较小;E2对斑马鱼胚胎的孵化率亦有抑制作用;在120hpf,TBC和E2对斑马鱼胚胎均有致畸效应但致畸形态有差异;TBC的EC50为1.248μg/mL,E2的EC50为0.968μg/mL及LC50为2.834μg/mL。结果表明,TBC在一定程度上可抑制雌激素对斑马鱼胚胎的毒性效应,呈现潜在的抗雌激素效应的内分泌干扰作用。     

食蟹猴-猪异种体细胞核移植胚胎的构建

[目的]探索食蟹猴—猪异种核移植胚胎的发育能力,为食蟹猴异种核移植胚胎干细胞的构建奠定基础.[方法]以食蟹猴和猪胎儿的耳部成纤维细胞为供体,猪MⅡ期去核卵母细胞为受体,构建异种核移植重构胚,并从核移植融合/激活方式、培养液两个方面进行优化.[结果]70枚食蟹猴—猪异种核移植胚胎中,有49枚分裂（70.0％）,与猪同种核移植胚胎的分裂率（76.6％）无显著差异;使用微卫星引物D15S823对食蟹猴—猪异种核移植胚胎进行遗传学鉴定,均能扩增获得D15S823条带（350 bp）;食蟹猴—猪异种核移植胚胎融合后1h的染色体早熟凝集率（24.2％）显著低于猪同种核移植胚胎（44.7％）和猪孤雌激活胚胎（100.0％）,通过使用无Ca2＋融合液能够显著提高染色体早熟凝集率（48.2％）;在PZM-3、HECM-10和HECM-10＋10％ FBS 3种培养液中,食蟹猴—猪异种核移植胚胎的分裂率无显著差异.[结论]食蟹猴体细胞核能够在猪MⅡ期去核卵母细胞胞质中发生核重塑,并发育到8-细胞阶段.     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

 【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带，去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后，体外培养重构胚。【结果】重构胚融合率和激活率分别为84.8％和93.6％；胚胎2-细胞发育率为24.7％，4-细胞率为6.74％；2-细胞期克隆胚移植假孕受体后，没有获得怀孕受体；分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植，结果表明，冷冻保存细胞的融合率（69.3％）与其余两组（80.6％和84.8％）呈显著差异（P＜0.05）；激活率、2-细胞和4-细胞发育率，则3组间差异不显著（P＞0.05）。【结论】本文将小鼠卵母细胞的化学去核与无透明带技术相结合，获得的克隆胚目前已发育到4－细胞期；另外，供体细胞的3种准备方式均不影响胚胎发育率。该方法属手工克隆，它的成功将会大大简化核移植程序，提高核移植总效率。     

不同氧气浓度对绵羊体外受精胚胎凋亡相关基因表达的影响

[目的]研究绵羊胚胎体外发育过程中细胞凋亡的机制,以进一步提高胚胎体外发育能力。[方法]利用Real-time PCR技术,分别检测凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3在低氧环境(5%O2)和高氧环境(20%O2)培养的绵羊体外受精(IVF)胚胎中的表达水平。[结果]不论是高氧环境还是低氧环境,从2-细胞阶段到囊胚期均可检测到Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3的表达,Caspase-3基因表达水平随着胚胎的发育有逐渐增高的趋势,且高氧和低氧间差异不显著(P0.05);从8-16细胞期开始,Mcl-1、Bad、Bak和Bik表达水平都显著增加,且低氧环境中的表达水平均明显低于高氧环境中的表达水平(P0.05)。[结论]氧气浓度在一定程度上影响了绵羊胚胎中凋亡相关基因的表达,绵羊胚胎细胞凋亡可能是凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3相互协同的结果。     

父源性印记基因在牛早期胚胎中的表达

【目的】研究父源印记基因在牛早期胚胎中的表达模式。【方法】利用Real-time PCR技术,检测Gnas、Grb10和Xist这3个父源性印记基因在牛体外受精（In vitro Fertilization,IVF）和孤雌激活（Parthenogenetic Activation,PA）胚胎各发育阶段的表达情况。【结果】对于IVF和PA两种来源的牛胚胎,Gnas在胚胎各发育阶段的表达没有明显差异;Grb10在2细胞阶段的PA胚胎中的表达量明显高于在IVF胚胎的,但从4细胞阶段到囊胚阶段,Grb10在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异;从2细胞阶段到8细胞阶段,Xist在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异,但从16细胞期开始,Xist在PA胚胎中的表达明显高于IVF胚胎的表达量。【结论】对于牛IVF胚胎和PA胚胎,Gnas、Grb10和Xist从2细胞期到囊胚期都可以检测到表达,但表达模式不同。这3个父源性印记基因在牛胚胎发育过程中可能发挥着重要的作用。     

牛-山羊异种体细胞克隆胚胎线粒体形态超微结构观察#br#

 【目的】通过对正常受精胚胎、山羊同克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)以及牛-山羊异种克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)中线粒体超微结构的观察与比对,从亚细胞水平揭示异种克隆胚胎出现异常的原因,为异种克隆技术的进一步研究提供新思路。【方法】利用透射电镜分别对山羊正常受精胚胎、山羊同种克隆胚胎及牛-山羊异种克隆胚胎的原核、2-细胞、4-细胞、8-细胞及桑椹胚阶段的早期胚胎进行线粒体超微结构观察。【结果】山羊自然受精胚胎、山羊同种克隆胚胎的线粒体均为帽状,随着胚胎的发育,线粒体由电子密度高、嵴少的未成熟状态发育为电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体,而牛-山羊异种克隆胚胎从2-细胞胚胎至桑椹胚都存在一种具有多个分叶的线粒体,但这种形态异常的线粒体同样也能够形成电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体。【结论】牛卵母细胞与山羊体细胞之间不能有效的进行核-质互作,本研究中具体表现为出现多分叶形线粒体,从而影响牛-山羊异种克隆胚胎的发育。     

小鼠胚胎电转外源物质条件的优化

旨在优化电转外源物质进入小鼠胚胎的条件,为电转CRISPR/Cas9系统进入小鼠胚胎进行基因编辑奠定基础。在不同的电转条件下分别将四甲基罗丹明标记的葡聚糖(Tetramethylrhodamine-labelled dextran)、带绿色荧光蛋白标记的质粒pLL3.7和体外转录的绿色荧光蛋白mRNA导入小鼠胚胎细胞,并进行培养,在荧光显微镜下观察胚胎发育状态,分析荧光染料进入胚胎及绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,高电压使胚胎成活率显著下降,低电压使电转效率显著下降。最适电压是110V,且小鼠胚胎2细胞期较1细胞期更适合电转。     

miRNA-145、Oct4和Sox2基因在小鼠早期胚胎发育分化中的表达情况

【目的】揭示miRNA-145、Oct4和Sox2基因与早期胚胎细胞表型间可能存在的关联,为阐明miRNA-145调控早期胚胎发育分化的分子机制奠定基础。【方法】利用手术法收集SPF级昆明小白鼠体内生产的2-细胞胚胎和囊胚,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小鼠2-细胞胚胎和囊胚中miRNA-145、Oct4和Sox2基因的表达情况。【结果】在小鼠早期胚胎由2-细胞胚胎发育至囊胚的过程中,miRNA-145在囊胚中的表达量显著高于在2-细胞胚胎中的表达量（P〈0.05,下同）,而Oct4和Sox2在囊胚中的表达量显著低于在2-细胞胚胎中的表达量。【结论】miRNA-145基因表达量上调与Oct4、Sox2基因表达量下调是随着小鼠早期胚胎发育分化的进行同时发生。