弗氏链霉菌双拷贝串联基因tylF、tylE和tylCV工程菌的构建

为提高弗氏链霉菌对泰乐菌素的产素能力,构建了弗氏链霉菌双拷贝串联基因tylF、tylE和tylCV基因工程菌。本研究以弗氏链霉菌作为出发菌株,并以其全基因组DNA为模板分别扩增tylF和tylE以及tylCV基因、以质粒pSET152为模板扩增强启动子基因permE,采用重叠延伸PCR技术和EcoRV、XbaI双酶切结合的连接方法,构建弗氏链霉菌表达载体pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV,并转化至大肠杆菌ET12567,利用大肠-链霉菌属间接合转移技术获得工程菌株。研究结果表明,工程菌株摇瓶效价(14580 u/mL)比出发菌株(11318 u/mL)提高了29%;液相色谱结果显示,工程菌株的泰乐菌素A和泰乐菌素C相对峰面积显著(P≤0.05)高于出发菌株。增加弗氏链霉菌tylF、tylE和tylCV的拷贝数可有效提高泰乐菌素的产量,以及优化组分,为泰乐菌素生产菌的遗传改造提供参考。     

响应面优化转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉液体发酵产纤维素酶的培养条件

研究采用响应面法并以滤纸酶活力(filter paper activity,FPA)作为响应值对转透明颤菌血红蛋白基因的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6-VHb菌株液体发酵产纤维素酶的发酵条件进行优化。根据单因素试验结果设计P-B试验,筛选出影响Tu6-VHb菌株发酵产酶的3个显著因素:吐温-80含量、发酵液体积(250 mL三角瓶发酵)、氮源浓度。用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域,运用响应面B-B试验设计确定3个显著因素之间的交互作用和最佳发酵条件。结果显示,Tu6-VHb产纤维素酶的最佳发酵条件是:吐温-80含量0.39%,发酵液体积61.32mL(250 mL三角瓶发酵),氮源浓度0.87%。经优化后,Tu6-VHb菌株发酵产纤维素酶酶活力达51.72U/mL,与模型预测值51.94U/mL相近,较优化前该菌株酶活力(39.984U/mL)提高了29.35%,是未转入透明颤菌血红蛋白基因的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6菌株酶活力(35.904U/mL)的1.44倍。     

响应面优化转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉液体发酵产纤维素酶的培养条件

研究采用响应面法并以滤纸酶活力（filter paper activity,FPA）作为响应值对转透明颤菌血红蛋白基因的里氏木霉（Trichoderma reesei）Tu6-VHb菌株液体发酵产纤维素酶的发酵条件进行优化。根据单因素试验结果设计P-B试验,筛选出影响Tu6-VHb菌株发酵产酶的3个显著因素：吐温-80含量、发酵液体积（250 mL三角瓶发酵）、氮源浓度。用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域,运用响应面B-B试验设计确定3个显著因素之间的交互作用和最佳发酵条件。结果显示,Tu6-VHb产纤维素酶的最佳发酵条件是：吐温-80含量0.39%,发酵液体积61.32 mL（250 mL三角瓶发酵）,氮源浓度0.87%。经优化后,Tu6-VHb菌株发酵产纤维素酶酶活力达51.72 U/mL,与模型预测值51.94 U/mL相近,较优化前该菌株酶活力（39.984 U/mL）提高了29.35%,是未转入透明颤菌血红蛋白基因的里氏木霉（Trichoderma reesei）Tu6菌株酶活力（35.904 U/mL）的1.44倍。     

抗氯霉素单链抗体基因工程菌表达条件优化

本实验通过绘制工程菌的生长曲线,确定其生长规律,从诱导物、诱导时机、诱导时间三个主要因素考察其对单链抗体表达的影响,旨在优化抗氯霉素单链抗体基因工程菌的表达条件结果表明:选择IPTG作为诱导物,在工程菌对数生长中期3 h开始诱导,诱导表达4 h结束,单链抗体的表达量可占菌体总蛋白的45%,为抗氯霉素单链抗体的进一步研究和生产应用打下基础。     

金霉素在养猪生产中的应用

<正>金霉素是Duggar于1948年从金色链丝菌的培养液中分离得到的一种微生物次级代谢产物,属四环素类抗生素,在国内外畜禽生产中以预防剂量(50～75毫克/千克)在饲料中使用,目的是促进畜禽生长。目前,金霉素在养殖业作为保健用药和预防     

表达重组猪α干扰素的大肠埃希工程菌分批发酵动力学模型的建立

为探究表达重组猪α干扰素的大肠埃希工程菌的分批发酵动力学基本规律,以表达猪α干扰素的基因工程重组大肠埃希菌BL21(DE3)为实验对象,观察并研究重组大肠埃希工程菌在30 L发酵罐分批发酵过程中菌体生长、重组猪α干扰素生成和基质消耗的变化规律,根据经典的Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程对其实验结果进行非线性回归分析。结果表明:菌体生长呈典型的S型曲线,蛋白生成和菌体生长无明显的相关性,属于非生长偶联型;重组猪ɑ干扰素的产生和大肠埃希工程菌的生长速率及菌体积累量相关,菌体生长、基质消耗和产物形成模型的拟合度R2分别为0.99030、0.91095和0.96683,能较好地描述发酵中的动力学特征;重组猪ɑ干扰素蛋白得率提高了40%,由此建立的模型将为后续的连续补料、高密度发酵和工业化放大生产奠定基础。     

ε-聚赖氨酸生产菌白色链霉菌UN2-71生理特性及其发酵条件优化

以实验室保藏的高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌UN2-71为生产菌株,研究其生理生化特性,以此指导新的ε-聚赖氨酸产生菌筛选;同时通过对发酵培养基以及摇瓶发酵条件的优化,最终确定白色链霉菌UN2-71的最佳摇瓶装液量30mL、最佳接种量10％、最佳发酵温度30℃、菌丝生长的最佳摇床转速150r/min、最适起始发酵pH值为7.0.经优化后,白色链霉菌UN2-71的ε-聚赖氨酸产量提高至2.37g/L,较优化之前的产量1.64g/L提高了44.5％.     

大黄鱼病原哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)拮抗菌的筛选及益生菌特征的分析

用点种法定性初筛,从65株由海洋生物体上获得的未知菌株中筛选出18株病原哈维氏弧菌的拮抗菌,用酶标法和牛津杯法定量复筛后,确定2株保持较好拮抗效果的菌株X14、X15为目的拮抗菌。在对两菌株益生菌特征分析的研究中,抗菌谱及生长曲线结果显示菌株X14、X15具有较广的抗菌性,且两株拮抗菌在相同的条件下可能较两株病原菌更具生长优势。药物敏感性试验结果表明,分离菌株菌对四环素、环丙沙星、庆大霉素等10种药物敏感。16S r DNA基因同源性分析的结果显示与X14、X15同源性达99%以上的菌株均来自链霉菌属(Streptomyces),进一步建立系统发育树,结果显示菌株X15与灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)相似性最高,但结合形态特征及理化性质不能将两菌株确定到种。筛选得到的菌株X14、X15在拮抗病原哈维氏弧菌、抗菌谱、生长优势及药敏性等方面均初步满足益生菌的筛选条件。     

工程菌产植酸酶摇瓶发酵条件初探

本实验根据毕赤酵母工程菌的特点,在摇瓶中对重组毕赤酵母工程菌株PP-MS-NPm-4-16的发酵条件进行初步研究。确定了60%麦芽-麸皮培养基,40%的蚕蛹培养和190mg/L的酵母营养盐作为高密度发酵的基础培养基,生长阶段和诱导阶段最佳pH分别为5.0和5.5。通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养条件为:接种量4%,甲醇浓度40g/L,生长阶段豆油浓度1.3%,诱导阶段豆油浓度3.5%,植酸酶酶活最高可达到192400U/mL。     

猪圆环病毒2型ORF2可溶性表达条件的优化

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。     

2种侵入型乳酸菌生物学特性的研究

本研究旨在选择性能优良的乳酸菌表达载体，为后期研发新型乳酸菌活菌疫苗奠定基础。试验对诱导型和组成型表达的2种侵入型乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA的生物学特性进行研究，从酸耐受性、胆盐耐受性、生长曲线、质粒稳定性、抑菌试验以及药敏试验这6个方面进行鉴定。结果表明，这2种乳酸菌在pH为2.5的酸应激条件下，存活率均达到125%，在质量分数为0.5%的高胆盐溶液中，存活率高达200%。2种类型的乳酸菌均能在9 h时达到平台期，生长性能优良，其中组成型表达菌株NC8-pLc23-FnBPA达到平台期时的D_{600 nm}值为1.3，高于诱导型表达菌株，生长性能优于诱导型菌株。pH生长曲线结果表明，乳酸菌产酸性能无明显性差异，在10 h时，溶液中的pH均降为3.5，产酸能力较强。2种类型乳酸菌的菌体和上清对常见致病菌均有不同程度的抑菌作用，其中菌体的抑菌效果优于上清，且表达FnBPA蛋白的组成型菌体的抑菌效果强于诱导表达型。2种侵入型乳酸菌均对绝大多数的抗生素敏感性高，具有一定的生物安全性。2种类型的乳酸菌的质粒稳定性均>90%。本试验发现诱导型乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA与组成型乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA具有相似的生物学特性，其中组成型乳酸菌表达蛋白更方便，无需添加诱导肽便可自主表达，更适合作为新型乳酸菌活菌疫苗的受体菌株，为后期乳酸菌活菌疫苗的研制提供便利。     

阿洛糖对非利用型单核增生李斯特菌生长影响的研究

为研究单核增生李斯特菌ICDC-LM188对阿洛糖的利用及阿洛糖对该菌株基因表达的影响,本研究利用含有不同碳源的MWB培养基和LB培养基分别进行单核增生李斯特菌在阿洛糖作用下的生长试验,采用RNA测序并进行主要差异表达基因分析。生长试验结果显示阿洛糖可以抑制ICDC-LM188生长。差异表达基因分析结果显示,5个上调表达基因均与已知的阿洛糖代谢相关,14个下调表达基因中部分与丙酮酸代谢相关,而丙酮酸代谢的抑制会影响菌体生长,推断丙酮酸代谢的抑制可能是阿洛糖抑制部分单核增生李斯特菌生长的原因。本研究为优化LAEB培养基提供了方向及对单增李斯特菌的糖代谢相关研究有借鉴意义。     

饲料霉变的危害与预防研究进展

霉菌毒素是霉菌产生的有毒代谢产物,家畜大量采食后导致的病理综合症称为霉菌毒素中毒。目前已知有三种主要的产毒菌:曲霉菌属、镰刀菌属和青霉菌属,这些霉菌的某些菌株当生长在具有适宜的温度、湿度和PH条件的基质(饲料)上时,将产生有毒代谢产物。黄曲霉毒素在玉米和花生中检出率较多,且花生上分离的黄曲霉有80%～90%能产生毒素,麦类则以镰刀菌及其污染为主,青霉及毒素在大米中检出率高,这些真菌毒素直接影响人畜的健康,危害性极大。1饲料霉变引起的危害1.1黄曲霉毒素黄曲霉毒素是一种具高毒性、诱变性和致癌性的化合物。从该化合物中可分…     

响应面优化法提高吸水链霉菌5-4菌株抗香蕉枯萎病的抑菌活性

为提高吸水链霉菌5-4的抑菌活性，本研究以拮抗Foc TR4病菌的抑菌率为响应值，采用响应面三步法对链霉菌5-4的发酵条件进行优化。大幅度提高了链霉菌5-4发酵提取物对香蕉枯萎病4号生理小种（Foc TR4）的抗真菌活性，其中可溶性淀粉（21.512 g/L）、氯化钠（4.734 g/L）、接种量（3.217%）是次级代谢物抗真菌活性高的关键因素，优化后的抑菌活性达到了88.36%，比优化前（54.96%）提高了33.4%。优化后发酵提取物（500 μg/mL）的校正孢子萌发抑制率达到100%，比优化前提高了36.38%，且经过提取物处理后Foc TR4病菌的菌丝出现明显的分叉增生、肿大等现象。链霉菌5-4发酵条件的优化可以为以后分离抑菌活性物质提供条件，也为后续菌株工业化生产奠定了基础。     

奇异根串珠霉菌拮抗放线菌的筛选与鉴定

本实验以奇异根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）为目标菌，通过平板梯度稀释法从槟榔根系土壤中分离获得放线菌，利用平板对峙法筛选对奇异根串珠霉菌具有抑菌活性的菌株，并通过发酵液复筛出4株抑制效果达90%以上的菌株，编号为D2-3、G1-12、D2-9和G9-4。通过培养特征、形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析对抑制率99.76%的菌株D2-3进行分类鉴定，初步鉴定该菌株为一株链霉菌，与桑树链霉菌（Streptomyces samsunensis）16S rDNA序列相似性为99.41 %。     

转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉菌株固体发酵产纤维素酶的能力研究

本试验对转入透明颤菌血红蛋白基因的里氏木霉菌株(Tu6-VHb)与未转入该基因的里氏木霉菌株(Tu6)固体发酵产纤维素酶的能力进行了比较分析,并对Tu6-VHb菌株固体发酵产纤维素酶的培养条件进行了响应面优化研究。结果表明,Tu6-VHb菌株比Tu6菌株具有更强的产纤维素酶能力,其产纤维素酶活力提高了61%。通过响应面优化试验,获得Tu6-VHb菌株固体发酵产酶的最佳培养条件为:碳源配比(即麸皮与稻谷杆的比例)为2.89,营养液氮源配比(即尿素与硫酸铵的比例)为0.90,初始pH值为5.02。在此优化条件下进行固体发酵,每克培养基可以产纤维素酶123.81 U/g,与预测最大响应值129.61 U/g接近,且固体发酵产纤维素酶的活力较未优化前提高了3.08倍。     

猪囊虫病疫苗用SOA工程菌的培养与发酵工艺

以摇床振荡培养猪囊虫病疫苗用ＳＯＡ工程菌,确定了其最佳培养条件：培养基为含０．２％葡萄糖的ＬＢ磷酸盐复合培养基（ｐＨ７．４）,诱导剂为１％乳糖,培养温度为３７℃。以此为基础进行工艺放大,研究了ＳＯＡ工程菌在７０Ｌ国产发酵罐中的发酵培养工艺,确定了接种量、ｐＨ、气压、溶解氧、温度等参数。试验结果显示,种子罐细菌量为ＯＤ６００＝４．０时,接种到发酵罐的菌体收获量最高;罐体气压在０．０５～０．２５ＭＰａ之间变动对工程菌产量、活菌数及表达量等均无明显影响;整个发酵过程中,发酵条件比较稳定,ｐＨ为７．４～７．０,溶解氧保持在１００以上,温度３６～３８℃,发酵时间８～１０ｈ。发酵结束,发酵液ＯＤ６００高达１１．２,活菌数为１０３亿／ｍＬ,表达量为１６．２％,重组质粒稳定。     

几株保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌在乳中发酵特性及优化搭配的研究

研究了不同来源的4株保加利亚乳杆菌和4株嗜热链球菌在乳中的生长发酵特性;进行了菌种优化搭配和最适配比菌株发酵产品贮藏特性的研究。结果表明:4株杆菌中,L.b-S1和L.b-DR凝乳时间最短,细胞生长速率和产酸代谢速率亦最快;4株球菌中,S.t-TX凝乳时间最长,细胞生长速率和产酸代谢速率亦最慢;杆菌和球菌的最适配比为:L.b-S1:S.t-SY为1:1或L.b-DR:S.t-SY为1:1,利用菌种最适配比,以2%的接种量42℃进行鲜乳发酵,3.5h均可凝乳,发酵产品活菌含量均高达1×109个/mL以上,酸度80～90°T,pH值均为4.5左右,感官风味俱佳;最适配比菌株发酵产品4℃冷藏21天时,酸度上浮不足10°T、pH值下降0.2～0.4,活菌数下降1个log数量级。     

1株田无链霉菌T2的鉴定及其对紫花苜蓿根腐病的防效研究

为了验证从紫花苜蓿根际土壤中分离出的1株对根腐病致病菌——镰刀菌(Fusarium spp.)具有抑制作用的菌株T2,试验通过形态学、生理生化试验、16S rDNA基因鉴定确定菌株种属，通过平板对峙试验及孢子萌发试验验证菌株T2对镰刀菌的抑菌能力，通过盆栽试验验证菌株T2对紫花苜蓿根腐病的防效。结果表明：经形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA基因序列分析，确定菌株T2为田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)。在平板对峙试验中田无链霉菌T2对腐皮镰刀菌(Fusarium solani,F.solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum,F.oxysporum)、轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides,F.verticillioides)的抑制率分别为37.33%、53.33%和37.00%。田无链霉菌T2无菌发酵液对腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌及轮枝镰刀菌孢子萌发抑制率分别为42.11%、43.94%和44.96%。盆栽试验中，田无链霉菌T2对苗期紫花苜蓿根腐病的防效为50.21%。说明单独接种田无链霉菌T2可以促进紫花苜...     

2种捕食线虫性真菌生长特性和捕食效力比较

对少孢节丛孢菌 (Arthrobotrys oligospora Strain:A1)和纺锤隔指孢菌 (Dactylella ellipsospora Strain:Da1)的生长特性和捕食效力进行了比较。结果表明 :少孢节丛孢菌菌株与纺锤隔指孢菌菌株的最佳生长温度不同 ,前者为2 0℃ ,后者为 2 5℃ ;少孢节丛孢菌菌株对无氧条件有一定的耐受性 ,而纺锤隔指孢菌菌株在无氧条件下不能很好生长 ;少孢节丛孢菌菌株与纺锤隔指孢菌菌株分别在其最佳生长温度 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,对马自然混合感染的线虫第 3期幼虫平均捕食率达 78.2 %和 80 .1% ,二者相比 ,纺锤隔指孢菌菌株捕食效力稍强