枣AP2/ERF转录因子鉴定及其响应枣疯病植原体表达分析

利用生物信息学方法，从植物转录因子数据库和NCBI数据库中分别得到175和164个候选的枣AP2/ERF转录因子序列，使用DNAMAN软件进行序列比对、去除重复序列，采用SMART软件预测蛋白结构域发现，枣基因组中包含有145个AP2/ERF基因，其中ERF、AP2、RAV亚家族分别含有116个、23个、5个，另有1个独立基因。预测枣AP2/ERF转录因子氨基酸数量在111 ~ 692之间，分子量在12 446.87 ~ 76 154.10之间，pI在4.31 ~ 10.11之间。鉴定出的145个AP2/ERF转录因子，105个分别定位到12条染色体上，40个未能定位。在此基础上，利用嫁接病芽方法将枣疯病植原体转至健康枣植株，通过转录组测序和qRT-PCR手段，分析了AP2/ERF转录因子对枣植原体侵染的响应，在植原体侵染枣的6个不同时期，枣AP2/ERF表达数量和表达量均不相同，共有48个差异表达基因，其中ZjAP2*9、ZjERF49和ZjERF91是响应枣疯病植原体最为重要的AP2/ERF转录因子。     

桃黄化病病原植原体的鉴定及16S rDNA序列分析

 对四川省成都市龙泉驿区桃植原体黄化病病原进行了研究。经DAP I荧光染色, 在荧光显微镜下观察到病叶叶脉韧皮部存在荧光点; 在透射电镜下病叶韧皮部存在植原体菌体, 其大小为40～650 nm, 平均大小350 nm, 单位膜厚度10～16 nm。利用植原体16S rDNA通用引物对桃植原体黄化病患病植株提取的DNA进行nested2PCR扩增, 获得115 kb的特异片段, 同时构建了16S rDNA系统进化树。桃黄化病植原体序列与油桃黄化NecY2In1 (nectarine yellows) 病原同源性最高。从而探明了桃黄化病病原为植原体及其分类地位。     

宁夏枣疯病植原体分子检测

运用国际上通用的植原体16S rRNA基因分子检测技术,对原产宁夏灵武市的灵武‘长枣品种’、‘灵武长枣1号’、‘灵武长枣2号’、‘灵武长枣3号’、‘灵武长枣4号’、‘灵武长枣5号’;原产宁夏中卫市的‘中卫大枣’和‘同心圆枣’和引进品种‘金昌1号’、‘敦煌大枣’(‘哈密大枣’)等10个品种品系样品的总DNA进行了巢式PCR扩增,结果这些材料没有携带枣疯病植原体,可以为飞速发展的宁夏枣产业繁育无毒优良品种苗木提供科技支撑。     

中国樱桃花变叶病相关植原体的分子检测及鉴定

从重庆市采集到表现花变叶症状的中国樱桃枝条样品,利用透射电镜在感病樱桃枝条韧皮部筛管细胞内观察到直径为200～500nm的圆形或者近圆形的植原体粒子。提取感病和健康花瓣的总DNA,利用植原体16S rRNA基因及延伸因子rp基因通用引物进行PCR扩增,从感病植株中扩增得到了长度分别为1.4kb的16SrRNA基因和1.2kb的rp基因。序列一致率分析表明,樱桃花变叶植原体16SrRNA基因和rp基因均与四川甜樱桃花变绿植原体相应基因的核苷酸一致率最高,分别为100%和99.8%;16SrRNA基因相似系数分析表明,樱桃花变叶植原体与四川甜樱桃花变绿植原体、枣疯植原体的相似系数均为1.00;基于16SrRNA基因和rp基因构建系统进化树时发现,樱桃花变叶植原体均与16SrV-B亚组成员聚为一簇,该植原体属于16SrV组的B亚组。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

植原体及马铃薯相关病害研究进展

植原体能引起多种植物的丛枝、缩叶、紫顶及果实和花畸形。近年来植原体引起的马铃薯病害已严重影响了马铃薯的质量和产量。对植原体病害的传播特点和植原体的分类学研究进行了概述，总结了植原体基因组和质粒研究现状，分泌蛋白、寄主抗病基因克隆和致病机理相关的研究进展；对几种马铃薯植原体病害进行阐述；讨论了植原体病害研究所存在的问题及发展趋势。以期为植原体病害研究、田间快速检测及病害流行预测、植原体重要功能基因挖掘和马铃薯抗病育种提供参考。     

国内外樱桃植原体（Phytoplasma）病害研究进展

植原体是一类无细胞壁、不能人工培养、存在于植物筛管内的专性寄生菌,世界各地已报道植原体可引起1 000余种各类植物系统性病害,涵盖农作物、园艺、花卉、果树和林木等,该病害传播性强、症状明显、危害较大,可不同程度引起植物生长发育异常或变异,甚至造成植株死亡。樱桃植原体病害就是其中一种,近年来该病害已经成为威胁樱桃产业发展最为重要的病害之一,主要引起樱桃花变叶(绿)及花器官、叶片、果实的生长发育异常和变异,并最终导致植株2～5 a(年)内迅速死亡,对我国乃至世界樱桃产业造成了非常重大的损失。随着我国近几年不同地区樱桃植原体病害发生面积、规模及危害程度地不断增加,尤其是笔者研究发现的重庆地区大规模爆发引起了极大威胁,使得有关其致病机制、植株生长发育特性及防治方法的系统研究显得迫在眉捷、尤为重要。针对樱桃植原体病害研究的需求,笔者综述了国内外有关研究进展,主要从植原体的分类、检测与传播以及樱桃植原体病害等多个方面进行阐述,为进一步开展樱桃植原体病害研究与防治等提供重要基础,并对未来的研究前景与应用价值进行了分析。     

河南部分地区番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染的分子鉴定

为调查河南省部分地区番茄病毒病危害情况,于2019年10月采集16份表现黄化、曲叶症状的番茄植株,利用分子生物学技术对其进行鉴定。结果表明:供试样品均被TYLCV(Tomato yellow leaf curl virus)侵染,31.75%的样品被TYLCV和ToCV(Tomato chlorosis virus)复合侵染;DNA全序列比对分析发现,供试样品中分离的TYLCV河南菌株与TYLCV-Is等地区的核苷酸序列同源性均达到94%以上,其中TYLCV-HN-AY-1分离物与TYLCV-Almeria(NC004005.1)序列相似性最高,为99.5%;对供试样品TYLCV抗病基因分子检测发现,部分番茄样品含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a,表明部分TYLCV株系已突破Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a的抗性。该结果对指导河南省番茄的安全生产具有重要意义。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。     

番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。     

Studies of potassium channel in pulmonary artery smooth muscle cells of pulmonary hypertension rats

AIM：In this work,we investigated the difference of membrane capacitance,membrane current,current density and I-V curves between smooth muscle cells isolated from pulmonary hypertension rat (PHR) or normotensive rat (NTR) pulmonary arteries.METHODS：Thirty young male Sprague-Dawley rats,aged 8-9 weeks,were used.Body weight was (200±20)g at the start of experiments.These rats were placed into a normobaric chamber for 6 h·day-1,6 day·week-1 for 4 weeks.Hypoxic exposure was accomplished by ventilation with room air and N2 resulting in a constant O2 concentration of (10±0.5)%.Whole cell recordings were made from smooth muscle cells freshly isolated from pulmonary arteries derived from PHR or NTR.RESULTS：The membrane capacitance of pulmonary hypertension rats was larger than that in SD rats;but membrane current and current density were lower than those in SD rats (P<0.05).The I-V curves of pulmonary hypertension rat were downward shift compared with that in SD rat.Iptakalim hydrochloride 10 μmol·L-1 significantly increased potassium currents.CONCLUSIONS：Membrane capacitance,membrane current,membrane potential are decreased,I-V curves was shift downward,compared with NTR.Iptakalim hydrochloride significantly increased NTR and PHR potassium currents.     

Enhancement of radiosensitivity and inhibition of p75NTR expression in esophageal cancer cell line Eca109 by a novel peptide P162 targeting to G3BP

AIM：To investigate the effect of a novel peptide P162 targeting to Ras-GTPase-activating protein SH3 domain-binding protein (G3BP) on the radiosensitivity of esophageal cancer cells and the expression of p75 neurotrophin receptor (p75NTR) in esophageal cancer stem cells. METHODS：
The proliferation inhibitory rate was measured by CCK-8 assay. Colony formation assay was performed to determine the radiosensitizing effect of P162 on Eca-109 cell line. Single-hit multitarget mode was used to plot survival curves. The morphological changes of Eca109 cells were observed under inverted microscope. The expression of surface marker p75NTR in human esophageal cancer stem cells was analyzed by flow cytometry. RESULTS：The peptide P162 inhibited Eca109 cell proliferation in a time- and dose-dependent manner. The radiosensitization enhancement ratios (SERDq) of P162 at concentrations of 2.5, 5.0 and 10 μmol/L were 1.54, 2.35 and 2.33, respectively. With the increase in the irradiation dose, the expression level of surface marker p75NTR was increased. Compared with simple irradiation group, the expression level of p75NTR was obviously decreased in P162 treatment group. CONCLUSION：The peptide P162 increases the radiosensitivity of esophageal cancer cell line Eca109, and inhibits the expression of p75NTR in esophageal cancer stem cells. This sensitization effect may be related to inhibition of esophageal cancer stem cells.     

苹果SSR反应体系的建立

为摸索适宜苹果的SSR反应体系,以金冠苹果为试验材料,研究了苹果SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。对SSR反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度以及退火温度进行了探索,确立了适合苹果的SSR反应体系为:在20μL反应体系中,Mg2+、引物和dNTP的最适浓度分别为2.5mmol/L、0.8μmol/L、0.10mmol/L;反应体系中TaqDNA聚合酶宜加入1U,模板DNA应加入15-30ng;引物的最佳退火温度为48.5-52.0℃。并利用该反应体系对10个苹果代表品种进行SSR反应,用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

甜樱桃SSR体系的建立、优化及应用

为摸索适宜甜樱桃的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化,20μL反应体系中,Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度为1.5mmol/L、0.2mmol/L、0.4μmol/L,Taq酶宜加入1U,模板DNA应加入10～40ng;引物的最佳退火温度为56.0～62.8℃。用10对引物及建成的反应体系对10个供试品种扩增,6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,共有29个等位位点,证实该体系稳定可靠。     

山楂ISSR分析体系的建立和优化

为在DNA分子水平上对山楂种质资源进行分析奠定基础,对退火温度、循环次数、DNA模板质量、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶的种类和浓度等影响ISSR反应的因素进行研究,建立并优化了山楂的ISSR分析体系。优化的山楂ISSR分析体系为:采用改进的CTAB法或QIAGEN试剂盒法提取总DNA;PCR反应体积为20μL,内含1×PCR反应缓冲液(Promega公司),3.0mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.3μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶(天根公司),50ng总DNA;扩增程序为94℃ 3min;94℃ 30s,退火温度1min,72℃ 2min,38个循环,72℃ 7min。筛选出了10个适宜山楂遗传分析的ISSR引物。     

枇杷SSR反应体系的建立及优化

为探索适宜枇杷的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化。结果表明：20uL反应体系中,Mg2＋、dNTPs和引物的最适浓度分别为1．5mmol．L-1、0．15mmol·L-1、0．2umol·L-1,Taq酶最适用量为1U,模板DNA最适用量为20ng;引物的最佳退火温度为51．0～60．0℃。利用该反应体系对17份枇杷种质进行扩增,电泳结果显示,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

番茄EST-SSR标记PCR反应体系的优化

应用L16 (44)正交实验优化番茄EST-SSR标记PCR反应体系.结果表明:20 μL体系中各反应物最适浓度为:DNA模板45 ng/20μL,引物0.75 μmol/L,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTPs0.4 mmol/L,Taq DNA酶0.5 U/20μL,且Mg2+对该标记反应体系影响最大.利用5对EST-SSR引物及P1、P2基因组DNA验证优化体系的可靠性,为该标记在番茄基因组分子标记辅助育种提供了试验依据.     

平菇ISSR-PCR反应体系影响因素研究

为提高ISSR分析结果的可靠性和可重复性,以平菇黑丰268为材料对反应体系进行优化,建立平菇ISSR-PCR反应体系.实验结果表明,平菇ISSR-PCR最优体系为体积20 μL,其中Mg<'2+>浓度为1.2 mmol·L-1,模板浓度为50 ng,引物浓度为0.6μmol·L-1,dNTPs浓度为200μmol·L-1,Taq酶浓度为1.2 U·20-1·μL-1,1×PCR Buffer.