一株好氧反硝化细菌的分离与鉴定

本试验旨在从环境样品筛选出一株具有去除氨氮和亚硝酸盐氮的好氧反硝化细菌。通过对采集水样进行富集驯化,利用溴百里酚蓝(BTB)选择性培养基进行初筛,并以去除氨氮、亚硝酸盐氮能力为指标进行复筛,得到一株好氧反硝化细菌DG-3。在好氧条件下测定了菌株DG-3的反硝化能力,并对其进行了形态学观察、生理生化试验和16S rDNA基因序列的分析。菌株DG-3在好氧反硝化培养过程中对硝酸盐氮(138.63 mg/L)的去除率达75.57%,在整个培养过程中,仅出现了少量的亚硝酸盐氮累积,其最大累积值仅为2.06 mg/L。反硝化培养基培养及扫描电镜观察结果显示,菌株DG-3为杆状,无鞭毛,大小为(1.7~2.8)μm×(0.6~0.7)μm,菌落呈淡黄色。结合形态学、生理生化特性及16S rDNA同源性比对分析,初步判断菌株DG-3为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)。菌株DG-3具有好氧反硝化能力,且能去除氨氮和亚硝酸盐氮,在水产养殖含氮废水的处理中具广阔的应用前景。     

适用于猪场沼液处理的好氧反硝化菌筛选及其脱氮特性评价

试验旨在筛选适合于猪场沼液处理的好氧反硝化菌。从活性污泥中分离获得 16 株好氧反硝化菌,其中菌株 ZH-14 的总氮(TN)和硝酸盐氮的去除效果最好,分别达到 50.73%和 99.99%。该菌株经过平板形态观察、功能基因和 16S rDNA 基因分析,鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。结果表明:菌株 ZH-14 在硝酸钾为唯一氮源培养基中生长时,48 h 后硝酸盐氮与 TN 的降解率分别为 100%和41.76%;以亚硝酸钠为唯一氮源培养时,亚硝酸盐氮降解率为 99.24%;以氨氮为唯一氮源培养时,氨氮的降解率达 94.1%;使用菌株 ZH-14 处理畜禽沼液,当其接种终浓度为 107 CFU/mL 时,经过 48 h 处理,氨氮、硝酸盐氮和化学需氧量的去除率分别为 54.4%、97.7%和 77.9%。综上表明,菌株 ZH-14 具有较强的反硝化和处理猪场沼液的能力,具有良好的应用开发前景。     

蓝狐源约氏乳杆菌菌株ZJBF004分离鉴定与体外益生潜能的评价

为获得犬科动物源乳酸菌并对其益生潜能进行评价,本研究通过测定生长曲线、产酸能力、对低pH和高胆盐环境的耐受性、在体外模拟胃肠道溶液中的存活能力、抑菌能力、抗生素抗性、对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力及抗氧化性评价了菌株ZJBF004的益生特性。结果表明:利用固体乳酸细菌培养基从蓝狐的肠道内容物中分离到1株优势乳酸菌,将其命名为菌株ZJBF004,经菌落菌体形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析鉴定其为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。菌株ZJBF004产酸能力较强且在37℃培养时能迅速进入对数生长期;在pH=5的培养基中耐受6 h时仍能保持较好的生长情况,在胆盐浓度为3 g/L的条件下至少可耐受6 h,且存活率高于70%,在人工模拟胃液和肠液中耐受3 h时存活率高于90%;对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果;对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力为(18.67±3.12)个/细胞;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为28.50%,表明菌株ZJBF004具有一定的抗氧化活性。由此可见,新分离的蓝狐源约氏乳杆菌菌株ZJBF004具有优良的体外益生性能,可作为潜在犬科动物用益生菌进一步研究。     

大肠杆菌磺胺类药物抗性基因的检测

为了解不同来源大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)对磺胺类药物的抗性,从鸡(128)、鸽子(86)和鹌鹑(36)的病变器官以及养殖场周围水(45)、土壤(35)中共分离到330株E.coli,应用肉汤微量稀释法和PCR方法,分离、鉴定磺胺类药物抗性菌株,检测抗生素抗性基因,分析抗生素抗性。结果显示,不同来源的330株E.coli分离株中,对磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲氧嘧啶的敏感菌株分别为118株(35.8%)、109株(33.0%)、95株(28.8%)、81株(24.5%)。磺胺类药物敏感菌株对抗生素的耐受能力依次为:氯霉素、青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、利福平;且病变器官分离菌株的抗生素抗性高于水、土壤中分离的菌株,鸡源分离菌株抗生素抗性高于鸽子、鹌鹑;菌株的磺胺类抗性基因sul1、sul2、int1检出率较高,Int2、sul3检出率较低。磺胺类抗生素抗性菌的抗性基因检出率依次为鸡、鸽子、鹌鹑、水、土壤。病变组织、水、土壤分离株中共检出182个抗性基因,其中,97株只含1种抗性基因,11株含2种抗性基因,6株含3种抗性基因,5株含有4种抗性基因,5株含有5种抗性基因。磺胺类抗生素抗性菌株有11株未检出抗生素抗性基因,而无磺胺类抗生素抗性的菌株有7株检出磺胺类抗生素抗性基因。结果表明,不同来源菌株的磺胺类药物抗性不同,E.coli的磺胺类抗生素抗性较高,且磺胺类抗生素抗性菌株具有多重抗生素抗性,E.coli磺胺类抗生素抗性的表现型与其基因型之间存在不完全吻合现象。     

一株降解氨氮菌株的筛选

以硫酸铵为唯一氮源的选择性培养基，通过富集培养，从天然养鱼池塘中筛选出一株能够降解废水中高浓度氨氮的菌株A4，并能耐受废水中的重金属离子，在造纸废水中48 h的降解速率为44%，通过革兰氏染色、菌落形态和分子生物学鉴定为木糖氧化无色杆菌反硝化亚种。     

太行鸡肠道益生菌的分离与鉴定

为了挖掘鸡源益生菌的菌种资源,试验采用肠道内容物分离纯化、生长曲线和产酸曲线绘制、抑菌性能测定、生化试验、基因测序、同源性分析、遗传进化树构建的方法对太行鸡肠道益生菌的种属和生物学特性进行了研究。结果表明:从散养太行鸡肠道分离、纯化了6株纯化益生菌,将其编号为J1～J6,其中J1～J4增殖速度快,2～10 h可达到对数生长期;6株菌均有一定的产酸能力,其pH值最低可达到3.78;6株菌对大肠杆菌和沙门氏杆菌的抑菌圈直径均大于14.67 mm,大肠杆菌对J3极度敏感,沙门氏杆菌对J1、J2极度敏感;生化试验显示,J1～J6依次为罗伊氏乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌;PCR扩增得到大小为1 500 bp的目的条带,菌株序列与GenBank比对的结果与生化试验结果一致;各菌株与其GenBank标准菌株的同源性为96%～99%;J2、J5与粪肠球菌标准株遗传距离较远,与标准株相比有显著遗传变异,其余菌株均与标准株遗传距离较近,其中J1和J4遗传距离最近,但J3、J6与其余菌株遗传距离均较远。说明鸡源益生菌J1、J2和J4具备作益生菌饲料添加剂菌种的特性。     

5株植物根际促生菌功能特性及培养条件

功能特性和培养条件研究是植物根际促生菌(PGPR)工业化潜力挖掘和开发的关键。为了进一步对菌株开发利用,选取前期研究中从珠芽蓼(Polygonum viviparum)、洽草(Koeleria glauca)、红三叶(Trifolium pratense)及草地早熟禾(Poa pratensis)根际获得的5株菌株为材料,测定菌株溶磷、固氮、分泌吲哚乙酸(IAA)能力等特性,利用16S rRNA分子生物学技术,确定菌株分类学地位;测定菌株生长特性、温度耐受性、pH耐受性、产气特性、产酸特性,确定菌株适宜的培养条件。结果表明:菌株M1溶有机磷量最高,为170.37μg·mL^?1,菌株Y3溶无机磷量最高,为308.50μg·mL^?1;菌株Y1、Y3、Y5、M1、M6均具有分泌IAA的能力,分泌量在24.23~164.74μg·mL^?1。菌株Y1和Y3具有固氮能力,固氮酶活性分别为175.30和255.55 nmol·(h·mL)^?1(C₂H₄)。通过对菌株生长特性测定,5株菌株在40 h均已进入生长稳定期,适宜的生长温度在25~31℃,适宜的生长pH范围为6.50~7.50,在LB培养基中生长无产气现象,生长过程中pH稳定在6.23~7.52,具有作为工业化发酵菌种的潜力。16S rDNA鉴定确定菌株Y5与Y3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),Y1为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides),M1为产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha),M6为猴假单胞菌属(Pseudomonas simiae)。本研究为菌株的工业化生产研究奠定了基础。     

5株解淀粉芽孢杆菌的益生特性及抑菌活性研究

【目的】探究5株自筛解淀粉芽孢杆菌(YN-BA1、YN-BA2、YN-BA3、YN-BA4、YN-BA5)的生长曲线、pH和胆盐耐受性、抑菌活性和抗生素敏感性等特性,为将其开发成微生态制剂应用于养殖中提供理论依据。【方法】采用比浊法测定解淀粉芽孢杆菌生长曲线,将5株解淀粉芽孢杆菌分别接种于经盐酸配制成pH为2.0、3.0、4.0和7.0的LB肉汤中培养2 h和0.3%胆盐环境中培养5 h,以评价其在人工胃肠液中的耐受性;采用琼脂打孔法测定体外抑菌活性,采用KB纸片法测定抗生素敏感性。【结果】5株解淀粉芽孢杆菌在经过0～2 h的缓慢生长和6～8 h生长速度降低后,其生长量快速上升,进入对数生长期;36 h后生长量下降,进入衰退期。5株解淀粉芽孢杆菌均具有不同的耐酸、耐胆盐能力,其中YN-BA2菌株在pH 2.0、3.0、4.0存活率分别为42.10%、51.50%和74.67%,均高于另外4株菌;在0.3%胆盐处理5 h后,YN-BA2菌株存活率为51.00%,高于另外4株菌,表明YN-BA2菌株的耐受力最高。5株解淀粉芽孢杆菌对肠炎沙门氏菌(YN-S1、YN-S2)、鸡白痢沙门菌(YN...     

纤维素降解细菌的筛选、生物学特性及降解效果

为了从东祁连山高寒草甸土壤中分离筛选纤维素分解细菌,本研究根据在羧甲基纤维素钠培养基和滤纸平板培养基上的生长情况,初步筛选出3株具有较强纤维素分解能力的细菌,并对其生长条件进行了初步研究,结果表明,3株菌的最适生长温度范围为25~30℃;最适生长pH因菌种不同位于5~8之间;最适生长盐浓度位于4%~5%。菌株X1-2具有较好降解特性,根据形态观察、革兰氏染色及16SrRNA系统发育比较,鉴定该菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.),是一株十分具有开发生产纤维素酶能力的菌株。     

肠炎沙门菌ArgG基因缺失株的构建及生物学特性分析

为研究ArgG基因对肠炎沙门菌的致病作用和生物学特性的影响，本试验利用λ-Red重组法构建肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并从生化特性、生长特性、生物被膜形成能力、运动能力、体外应激、巨噬细胞存活能力等方面进行研究。结果显示，与野生型菌株相比，ArgG基因缺失株生化特性、运动能力无明显变化，在LB培养基中生长速度变化不明显，但在M9培养基中缺失株不生长；ArgG基因缺失株生物被膜形成能力下降约60%,抗酸、碱应激能力分别下降约12%和10%左右，巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力降低。本研究成功构建了肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并证明ArgG基因与营养代谢、抗应激能力和毒力密切相关，为肠炎沙门菌的基因缺失苗的研究提供理论依据。     

Minimal nitrogen requirements of Corynebacterium renal strains

Corynebacterium renale strain 10849 was grown in a chemically defined medium containing glucosamine, ammonium sulfate, and 5 amino acids as possible nitrogen sources. Although glucosamine was slightly stimulatory, its omission from the medium had a minimal effect on growth, and washed cells introduced into glucosamine-free medium grew readily through 10 serial transfers, demonstrating that this compound was not required for growth. Individual omissions of isoleucine, valine, methionine, and glutamine resulted in lengthened lag periods and reduced growth rates in initial transfers, but recovery occurred in subsequent serial transfers so that by the 3rd or 4th transfer, growth rates and cell crops were only slightly less than in control cultures in complete medium. Omission of cystine resulted in a permanently low growth rate and reduced cell crop, but this was remedied by substituting various nonnitrogenous compounds containing reduced sulfur. Strain 10849 and 6 additional strains were then serially cultured in a minimal defined medium in which sodium thioglycolate provided reduced sulfur and ammonium sulfate served as sole nitrogen source. Since only ammonium ion was required as the nitrogen source, it could be concluded that C renale, which rapidly hydrolyzes urea, should find an adequate source of nitrogen for growth in the urinary tract of animals.     

山西地区褐土胶质芽孢杆菌生物学特性研究

从山西地区褐土中筛选出6株胶质芽孢杆菌,以辽宁菌种保藏中心提供的胶质芽孢杆菌(编号K0)为参照菌株,对其形态学、生理生化特性、耐盐性、耐酸碱性、温度敏感性等特性进行了测定。结果表明,这些菌株均为革兰氏阴性杆菌,产生圆形芽孢和丰厚的荚膜,菌落透明隆起,粘性强;过氧化氢酶试验呈阳性,能水解淀粉,VP阴性,不产生吲跺。K5、K0在3%NaCl浓度的培养基上能生长;在25~30℃供试胶质芽孢杆菌均能良好生长。研究可为高效胶质芽孢杆菌菌株材料的获得以及研制生物钾肥提供实践及理论基础。     

猪源大肠杆菌O157∶H7耐药表型和消毒剂抗性调查

为了调查广西猪源大肠杆菌O157∶H7分离株的耐药表型和消毒剂抗性情况,本研究测定5株猪源大肠杆菌O157∶H7广西分离株的药物敏感性和消毒剂抗性,并应用PCR对5株细菌的耐氨基糖苷类抗生素基因:氨基糖苷磷酸转移酶基因aph(3)-Iia、乙酰转移酶基因aadA和aadB进行扩增。27种抗菌药物的敏感结果表明,5株菌株只对氟苯尼考、头孢曲松、头孢西丁和头孢噻肟敏感;对罗红霉素、多黏菌素B、利福平、林可霉素、阿莫西林、氨苄西林和头孢噻吩的耐药率为100%;对壮观霉素、链霉素、头孢拉定等药物的耐药率在20%~60%之间。在5株大肠杆菌O157∶H7广西分离株中,分别有1株、1株和3株菌株对23种、11种和9种抗菌药产生耐药性。PCR结果证实,5株细菌携带有耐氨基糖苷类抗生素基因,耐药基因的存在与其耐药表型有一定的相关性。消毒剂抗性结果显示,5株细菌对聚维酮碘溶液、新洁尔灭消毒液、稀戊二醛溶液、双季铵盐—碘消毒液、复方过氧乙酸具有抗性,只对二氯异氰尿酸钠粉敏感。研究结果对预防和控制广西大肠杆菌O157∶H7提供了数据。     

Isolation and Identification of an Aerobic Denitrifying Bacterium

The present study was aimed to isolate an aerobic denitrifying bacterium from environmental samples.The collecting water samples were enriched and domesticated,the bromothymol blue (BTB) selective medium were used for screening.Based on the aerobic denitrification activity,ammonium and nitrite nitrogen removing ability,the strain DG-3 was isolated from the sample.The strain was identified according to its aerobic denitrification ability,morphological,physiological and biochemical properties and phylogenetic analysis of its 16S rDNA sequence.The results showed that the reduction efficiency of strain DG-3 was up to 75.57% under aerobic conditions with initial NO₃^--N concentration of 138.63 mg/L,and the accumulated nitrite appeared during the process of denitrification,the max concentration was 2.06 mg/L.The morphology of strain DG-3 was with an average size of (1.7 to 2.8)μm×(0.6 to 0.7)μm and a pale yellow surface.DG-3 was identified as Pseudomonas mendocina by morphological and biochemical characteristics and molecular properties.It could be concluded that DG-3 had an aerobic denitrification ability with removing ammonium and nitrite,which showed a great potential in nitrogen wastewater treatment.     

青海箭筈豌豆根瘤菌的筛选及其共生体耐盐性研究

箭筈豌豆是我国传统肥饲兼用的豆科绿肥作物,有关箭筈豌豆根瘤菌的研究尚属空白。为获得抗逆性强的根瘤菌菌株,在青海主产区采集样本,经分离、鉴定得到61株箭筈豌豆根瘤菌。采用水培回接法,通过主成分分析筛选出5株对宿主结瘤生长促进作用较强的根瘤菌(J1-3-2、J2-6-2、J3-12-1、J4-3-3和J5-5-3)。对该5株根瘤菌进行了离体耐盐性评价,发现菌株J5-5-3最大耐盐极限值在0.9%左右,其他4菌株最大耐盐极限值均在1.2%左右,并且5菌株的耐盐特征呈3个明显不同类型:J3-12-1和J2-6-2耐盐性最强,菌株J1-3-2和J4-3-3居中,菌株J5-5-3最差。进一步采用盆栽方法评价了其中3株(每类型1株)根瘤菌-箭筈豌豆共生体的耐盐性,结果表明,在0.15%NaCl胁迫下接种根瘤菌J5-5-3植株结瘤数最多,在0.30%NaCl胁迫下3种接种处理无显著差异;在0.15%和0.30%NaCl胁迫下,接种J3-12-1共生体株高显著大于对照(P<0.05);在0.15%和0.30%NaCl胁迫下根瘤菌J3-12-1和J5-5-3可显著提高植株干重(P<0.05);J5-5-3在0.15%和0.30%NaCl胁迫下可显著提高植株含氮量并显著提高0.15%NaCl胁迫下的植株吸氮量(P<0.05);J3-12-1显著提高了0.15%NaCl胁迫下的植株吸氮量(P<0.05)。综合来看,J3-12-1和J5-5-3可以作为在盐胁迫下提高箭筈豌豆生物量和含氮量的预选菌株。     

三株脱氮细菌脱氮特性的研究

对脱氮菌F4、F6、F7的脱氮特性进行研究,并评估其对水产养殖废水的脱氮处理效果。结果表明:三株菌均能利用酒石酸钾钠、乙酸钠、丁二酸钠、枸橼酸钠作为唯一碳源,而三株菌以酒石酸钾钠为碳源时脱氮活性最高;在C/N<12的情况下,三株菌的脱氮活性随着C/N的增加而快速升高;三株菌均嗜好弱碱性环境(pH 8～9);三株菌的脱氮活性在温度25～30℃时最好;在脱氮过程中,培养液pH值一直呈上升趋势。三株菌有较强的脱氮能力,在养殖废水处理中有广泛的应用前景。     

苜蓿根瘤菌绿色荧光蛋白标记株的构建及对菌株结瘤固氮能力的影响

以苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti12531,Sinorhizobium meliloti343和苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti GN5为受体菌,以Escherichia coli pRK2073为辅助菌及绿色荧光蛋白GFP104为供体菌,采用三亲本杂交法进行结合转导。以Winogradsky无氮培养基和TY培养基对标记菌株进行荧光表达及固氮特性的遗传稳定性检测,再对选出的荧光标记菌株以甘农5号紫花苜蓿和WL.343紫花苜蓿为宿主进行回接验证,测定了回接植物的生物量,结瘤数和标记菌的占瘤率等指标。结果表明:(1)三亲本杂交法适用于苜蓿根瘤菌GFP荧光标记菌株的构建,能以S.meliloti 343、R.meliloti GN5和S.meliloti 12531为出发菌株成功构建荧光标记菌株;(2)传代筛选后得到的荧光标记菌株中,S.meliloti 343-gfp2、R.meliloti GN5-gfp4和S.meliloti12531-gfp4遗传稳定性好,荧光表达量高;(3)含抗生素Winogradsky无氮培养基平板筛选与现有含抗生素平板分离筛选法相比,能显著提高荧光标记根瘤菌株的筛选效率;(4)获得的苜蓿根瘤菌荧光标记菌株间无显著差异,对标记菌株形成根瘤的固氮能力,及标记菌株对苜蓿植株生物量的影响进行比较,GFP荧光标记根瘤菌具有较高的遗传稳定性。     

Killing of Streptococcus uberis by bovine neutrophils following growth in chemically defined media

Following growth in a chemically defined medium (CDM), five strains of Streptococcus uberis were tested for their ability to survive killing by bovine neutrophils. Strains 0140J, ST10, EF20 and C221 were easily killed, whereas strain C197C was highly resistant. The ability of strain 0140J to resist phagocytosis and killing was increased by supplementation of the growth medium with milk whey, casaminoacids, casein, or, to a lesser extent, bovine serum. Supplementation of the growth medium with yeast extract or bovine serum albumin did not affect the resistance of this strain. Following growth in CDM supplemented with casein, strains ST10 and C221, like strain 0140J, were significantly more resistant to killing by neutrophils. The resistance of strains EF20 and C197C was unaffected by the addition of casein to the medium; strain EF20 remained susceptible and strain C197C highly resistant to killing. The effect of supplementing the growth media with components other than casein was only studied for strain 0140J. Decapsulation of strains C197C, ST10 and 0140J, grown in CDM + casein, with type-X hyaluronidase did not significantly affect their ability to survive in the presence of bovine neutrophils.