猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型(PCV2)遗传变异情况,对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明,测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp,2株全长为1 767 bp,5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%~99.5%之间,与Gen Bank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%~99.7%之间;遗传进化树显示,3株属于新出现的PCV2d亚型毒株,2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。     

腹泻仔猪中猪圆环病毒2型的检测及生物信息学分析

为研究仔猪腹泻中猪圆环病毒2型(PCV2)的生物信息,参考Gen Bank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计并合成一对特异性引物,从四川地区猪场送检的腹泻仔猪病料中扩增PCV2全长基因序列,回收PCR产物。将其插入PMD19-T载体,构建了重组质粒,转化后筛选、提取阳性重组质粒进行测序。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外的不同分离株进行生物信息学分析。结果表明,分离株基因组全长为1 767 bp,分离的三株基因组与Gen Bank上已发表的PCV2分离株之间的核苷酸同源性分别为1#94.7%~89.6%、2#94.7%~89.3%、3#96.4%~86.8%,氨基酸序列同源性为1#97.9%~95.7%、2#97.1%~95.5%、3#98.4%~94.8%,说明四川地区腹泻仔猪病料中PCV2的变异相对保守。     

1株麻雀源坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

从山东地区某发病鸭场周围的麻雀体内分离到1株坦布苏病毒,命名为SDS株,并对分离毒株进行毒力测定。应用RT-PCR技术对分离株全基因组进行扩增并测序,将获得的SDS株坦布苏病毒全基因组序列与已在Gen Bank发表的24株坦布苏病毒和6株其他黄病毒属病毒全基因组序列进行遗传进化分析。结果表明,该株坦布苏病毒的基因组全长为10 990 nt,包含94 nt的5'端非编码区、618 nt的3'端非编码区和一个开放阅读框(3 425个氨基酸),编码11种病毒蛋白;与Gen Bank已发表的坦布苏病毒的核苷酸序列同源性为98.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为98.1%~99.4%,其中与鸭源WFZ株(KC990545.1)的核苷酸序列同源性最高为99.5%,与鹅源坦布苏病毒(duck eggdrop syndrome virus strain goose,JQ920424.1)和鸡源坦布苏病毒(CJD50,JF926699)的核苷酸序列同源性较低为98.9%。用Net NGlyc 1.0 Server在线软件对病毒蛋白潜在糖基化位点进行预测,结果表明在SDS株病毒多聚蛋白中共有13个潜在的糖基化位点,分别位于5个不同病毒蛋白中。     

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。     

牛巴贝斯虫lytB基因的克隆与序列分析

为了对牛巴贝斯虫lytB基因进行克隆与序列分析,试验以兰州株牛巴贝斯虫lyt B基因组为模板进行PCR扩增,将扩增得到的特异性产物克隆到p GEM-T Easy载体上,并对其进行PCR检测、酶切鉴定及序列测定分析。结果表明:试验克隆得到的864 bp基因片段与Gen Bank收录的牛巴贝斯虫lyt B核苷酸序列同源性为97.8%。说明试验成功克隆出牛巴贝斯虫lyt B基因,与Gen Bank收录的牛巴贝斯虫lyt B核苷酸序列具有高度的同源性。     

犬细小病毒山东流行株分离鉴定及其全基因组测序分析

为了解山东地区犬细小病毒的流行及其变异情况,应用F81细胞从山东地区送检的发病犬粪便中分离出4株细小病毒,根据PCR和电镜技术对其进行鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆测序与序列分析。结果表明:所分离到的4株病毒均能在F81细胞上产生明显的细胞病变,经PCR及电镜观察鉴定为犬细小病毒,分别命名为QN1/QN2/QN3/QN4株。全基因组分析结果显示,除QN3株的基因组全长为4 756 nt外,其余3株均为4 757 nt;4个分离株之间全序列核苷酸同源性为99.31%,与GenBank登录的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比对,同源性为98.2%⁹9.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%99.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%⁹9.9%,氨基酸序列同源性为98.1%99.9%,氨基酸序列同源性为98.1%¹00%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,同属于NewCPV-2a亚型。     

猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆和序列分析

根据Genbank已发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)全基因组序列,设计两对特异性引物,建立了PCV-2全基因组的克隆和序列分析方法,并对甘肃省两个规模化养猪场采集的疑似PMWS病料进行了全基因克隆和序列分析,确定了PCV-2毒株基因序列的变异情况。结果表明,PCV-2核苷酸序列稳定,1株标准株与2株分离株全基因序列均由1 768 bp组成,彼此间序列的同源性达94.0%~99.8%,2个分离株之间同源性达94.2%~99.8%;分离株与标准株和Genbank已发表的23株PCV-2毒株参考毒株同源性达92.6%~100%。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒Shaanxi株前病毒全基因组克隆及生物信息学分析

为研究山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)Shaanxi株前病毒全基因组序列,本研究根据Gen Bank中收录的ENTV前病毒基因组序列设计5对引物,通过PCR方法从肿瘤组织中分段扩增获得了ENTV前病毒全基因组的5个片段,测序并分析。结果显示该病毒基因组全长7 275 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及5'端非编码区;ENTV Shaanxi株基因组全序列与NC004994.2、AY197548.2、ENTV-SC株(HM104174.1)核苷酸同源性分别为89%、89%、99%。本研究为ENTV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研究其检测方法与致病机理奠定了基础。     

口蹄疫病毒3ABC基因的克隆与测序

参考 Gen Bank中发表的猪源 O型口蹄疫病毒 3 ABC的基因序列 ,设计一对特异引物 ,以猪源 FMDV/ O/ CC株基因组 RNA为模板 ,RT-PCR扩增 3 ABC基因 ,并克隆到 p MD1 8-T载体中。测序结果显示 ,FMDV/ O/ CC株 3 ABC基因 c DNA长 1 2 81 bp,编码为 42 7个氨基酸残基组成的多肽。核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性比较发现 ,FMDV/ O/ CC株和 FMDV/O/ TW/ 99株 3 ABC基因亲缘关系密切。核苷酸同源性为 97% ,推导氨基酸序列同源性为96.3 %。     

猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型（PCV-2）全基因组序列,设计2对特异性引物,对山东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征（PMWS）组织病料进行了PCV-2全基因组克隆和序列分析。结果表明,PCV-2核苷酸序列较稳定,不同地区8个PCV-2毒株全基因组序列均由1 767 bp组成,彼此间核苷酸序列同源性达97.3%～99.8%,亲缘关系密切;与GenBank已发表的PCV-2参考毒株的同源性介于95.6%～99.8%。而ORF2的核苷酸序列同源性只有91.6%～99.9%。     

鹅细小病毒YBLJ株NS1基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆鹅细小病毒(GPV)NS1基因,并对其进行生物信息学分析,试验参照Gen Bank发表的GPV全基因组序列(U25749)设计扩增GPV-NS1基因的1对特异引物,经PCR扩增,将克隆的GPV-NS1基因进行TA克隆和转化,对鉴定正确的质粒进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明:YBLJ株GPV-NS1基因全长1 884 bp,编码627个氨基酸,与其他11株GPV的NS1基因核苷酸同源性为93.6%~99.9%,氨基酸同源性为96.2%~99.8%;蛋白二级结构中α螺旋占31.42%,β折叠占19.30%,无规则卷曲占49.28%;蛋白三级结构中α螺旋和β折叠占GPV-NS1总蛋白的一半以上的比例。说明GPV-NS1基因和其编码的氨基酸均较保守,尤其氨基酸更为保守,提示NS1蛋白虽然是非结构蛋白,但其对于GPV应该是至关重要的功能蛋白。     

朗德鹅圆环病毒全基因组序列测定和遗传演化分析

圆环病毒可以引起免疫抑制,从而造成其他病原的并发和（或）继发感染。为研究鹅圆环病毒（Goosecircovirus,GoCV）全基因组的分子生物学特性,运用重叠PCR技术从江西朗德鹅组织脏器提取的DNA中扩增出2条核苷酸序列,用Lasergene v7.1 DNAStar软件对拼接后的鹅圆环病毒江西株核苷酸组成、基因组结构及病毒的遗传变异进行分析。结果表明,所获病毒（简称GoCV-JX1）核酸全基因大小1821 nt,与GenBank登录的浙江永康株（No.DQ192280）GoCV的核苷酸同源性最高,高达98.6%。GoCV-JX1为我国江西朗德鹅群中首次报道并被测定全基因的鹅圆环病毒。     

广东省猪圆环病毒2型基因的克隆与序列分析

根据Gen Bank已发表的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)全基因组序列,设计1对特异性引物,对广东省不同地区规模化猪场采集的临床诊断为断奶仔猪多系统消耗综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的组织病料进行了PCV2基因克隆和序列分析。结果表明,采集的PMWS病料均可扩增出PCV2完整基因序列,与Gen Bank已发表的PCV2参考毒株序列核苷酸同源性达93.7%~99.8%,亲缘关系密切。其中10个PCV2基因全长1767 bp,属于PCV2b亚型,1个PCV2基因全长1768 bp,属于PCV2a亚型。     

羊口疮病毒湖北株F1L基因克隆与遗传进化分析

为了分析羊口疮病毒湖北株(ORFV-HB-YX株)F1L基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的ORFV-F1L基因序列设计特异性引物,对ORFV-HB株F1L基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示:F1L基因PCR扩增产物大小为999 bp,编码333个氨基酸,系统进化树显示HB-YX株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,与福建FJ-GO株同源性高达98%,亲缘关系最近,属于同一分支。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒 (MPV) FM株基因组核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,分别对国内 2株番鸭细小病毒分离株 MPV扬州 (YZ)株和 MPV佛山 (FS)株主要结构蛋白 (VP2和 VP3)基因进行 PCR扩增 ,并克隆到p CR3.1T载体 ,经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较。结果表明 ,MPV YZ和 MPV FS的VP2 - VP3基因大小均为 176 4bp,编码 5 88个氨基酸。 MPV YZ、MPV FS与 MPV FM核苷酸序列同源性分别为98.5 %和 98.6 % ,氨基酸序列同源性为 97.1%和 97.8% ;MPV YZ与 MPV FS核苷酸序列的同源性为 99.5 % ,氨基酸序列同源性为 98.8%。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株（QY株）的F基因和HN基因.然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662 bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸.经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%.     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

一株猪捷申病毒全基因组序列测定及分析

根据Gen Bank已发表的猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)13种血清型全基因组序列,分析其保守区域并设计10对特异性引物。从临床腹泻病料中提取核酸,经RT-PCR扩增目的片段,分别对这些片段进行克隆、序列测定、拼接,最终获得一株猪捷申病毒全基因组序列,命名为PT-GD。主要结构蛋白VP1进化分析表明,该毒株与PTV12型CC25、YZ119的VP1核苷酸序列同源性分别为80.1%和79.7%,与其他血清型毒株进化距离相对较远,表明该毒株为猪捷申病毒血清型12型。该病毒全基因序列的测定及血清型鉴定为进一步深入研究猪捷申病毒在我国的遗传变异及其生物学特性提供了依据。     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2-VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物,对国内两株鹅细小病毒毒株(GPV　CC株)和(GPV　FS株)主要结构蛋白（VP2-VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体，分别获得正向、反向连接重组质粒pVPC1、pVPC2和pVPF1、pVPF2，经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV　CC株和GPV　FS株VP2-VP3的核苷酸大小分别为1　764　bp和1　763　bp,其中GPV　CC株与A株同源性达到98.9%；GPV　FS株缺失一个碱基,与A株同源性为93.5%,与GPV　CC株同源性为93%。