兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立和应用

以兔多杀性巴氏杆菌的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的多杀性巴氏杆菌的16SrRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了兔多杀性巴氏杆菌PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60cfu/mL,使用建立的PCR方法扩增兔多杀性巴氏杆菌标准株和分离株均能扩增出643bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本试验所建立的兔多杀性巴氏杆菌病原PCR检测方法敏感、特异、可靠。     

牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体双重PCR检测方法的建立及应用

参照Gen Bank中牛多杀性巴氏杆菌kmt1基因序列(AF016259)和牛支原体opp D/F基因序列(AF130119),设计两对引物,在建立两种细菌单项PCR检测方法的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了两种细菌的双重PCR检测方法,用这两对引物对同一样品中的牛多杀性巴氏杆菌、牛支原体核酸为模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体的265bp和439bp的特异性片段,而对其他4种牛病原菌的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,对牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体的最低核酸检出限均为1pg。通过对30份临床病料检测,将建立的双重PCR技术和单项PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明,建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体的同时检测和鉴别诊断。     

产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重PCR检测方法的建立

为建立快速特异的PCR方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌,本研究根据GenBank登录的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和toxA毒素基因序列,设计合成了2对特异引物。特异性试验表明产毒素多杀性巴氏杆菌C51-6扩增出了460bp和1854bp的2条目的片段,而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性;敏感性试验表明该PCR方法能从含450CFU的菌液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验对该PCR方法进行了验证。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白基因(fimN)序列设计了一对引物,扩增出大小为648bp的目的基因片段,建立了快速检测兔支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌均无交叉性反应。用该PCR法检测了从杨凌、咸阳采集的50份表现临床症状的兔呼吸道分泌物检出支气管败血波氏杆菌阳性35例,阳性率为70%。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较,结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的3.89倍,是微量凝集法的1.94倍。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

目的建立可以同时检测猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速而可靠的PCR检测方法。方法和结果根据胸膜肺炎放线杆菌的Apx-VIA基因序列、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因序列设计5条引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模板的PCR扩增产物大小分别为342bp,485bp和1258bp。复合PCR对1～12型猪胸膜肺炎放线杆菌标准株,6株多杀性巴氏杆菌标准株,1～15型副猪嗜血杆菌以及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检测,均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等14种常见细菌作为阴性对照进行PCR检测,结果仅有支气管败血波氏杆菌产生了可以和上述三个特异性条带明显区分的PCR产物。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的敏感性分别为14pg、34pg和37pg。结论本研究建立的复合PCR特异性好,敏感性高,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR快速检测方法的建立及应用

参考GeneBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因序列设计了一对特异性引物,扩增出大小为387bp的目的基因片段,优化PCR反应条件,建立了兔支气管败血波氏杆菌的PCR快速检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、魏氏梭菌和巴氏杆菌均无交叉反应,且检出最低浓度为10pg,可用于临床检测。     

利用菌落多重PCR方法进行不同动物来源多杀性巴氏杆菌鉴定的研究

参照文献报道的多杀性巴氏杆菌种和荚膜型的特异基因合成6对特异引物,建立多杀性巴氏杆菌鉴定的菌落多重PCR方法,结果5株多杀性巴氏杆菌荚膜型参考菌株均扩增出了相应的预期片段,而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌的扩增均为阴性。利用此多重PCR方法对48株不同动物来源的多杀性巴氏杆菌进行了鉴定和荚膜型分型,同时与间接血凝试验以及Biolog细菌快速鉴定系统进行比对,结果表明,所建立的多重PCR方法与间接血凝试验、Biolog细菌快速鉴定系统的符合率均达到100%。     

猪支气管败血波氏杆菌PCR诊断方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）鞭毛蛋白基因的上游序列设计了1对引物flal和fla2，扩增出大小为237bp的目的基因片段，建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明，该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和D型多杀性巴氏杆菌均无交叉性反应；最低能够检出112．5pg的模板DNA。用该PCR法检测了从延边州采集的48份表现不同临床症状的猪鼻黏液；结果，检出支气管败血波氏杆菌阳性42例，阳性率为87．5％。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较；结果显示，该PCR法的检出率是细菌检查法的5．25倍，是微量凝集法的1．75倍。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物，扩增特异的650bp棱酸片段，建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明，12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测．结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明，病变部位不同，胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同，其中以扁桃体的检出率最高。     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立

为建立一种快速准确检测兔多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的PCR方法,本研究以P.multocida的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的P.multocida的16S rRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了P.multocida PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60 cfu/mL,采用该PCR方法扩增P.multocida标准株和分离株均能扩增出643 bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本实验所建立的P.multocida PCR检测方法快速、敏感、特异、可靠,可用于P.multocida的快速鉴定与诊断。同时用建立的PCR方法对临床疑似病兔的脏器分离菌进行扩增,可扩增出目的条带,与细菌的分离结果相一致。     

兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR检测方法的建立

参考GenBank中兔巴氏杆菌16SrRNA和波氏杆菌的fim2的基因序列,应用Premier 5.0软件在二者高度保守区设计了2对引物,建立了适合巴氏杆菌和波氏杆菌快速检测的多重PCR检测方法。以该方法对巴氏杆菌和波氏杆菌参考菌株进行PCR扩增,分别能从各自的基因组中扩增出与试验设计相符的644bp和425bp的特异性DNA片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果表明分别为巴氏杆菌16SrRNA和波氏杆菌fim2基因序列。该方法对波氏杆菌的检测下限为4×102 CFU,对巴氏杆菌的检测下限为6×101 CFU。对兔源性沙门菌、葡萄球菌、大肠杆菌、魏氏梭菌扩增结果为阴性。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于鉴别诊断兔巴氏杆菌和波氏杆菌以及2者混合感染。     

菌落多重PCR鉴定不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌

参照文献报道的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和荚膜生物合成位点hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJf、cbD基因的序列合成了6对特异性引物,建立了多杀性巴氏杆菌种和型的菌落多重PCR方法。结果表明,本所保藏的A、B、D、E、F各型多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Biolog鉴定结果和Carter氏间接血球凝集试验结果相一致;而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、猪链球菌和粪肠球菌的扩增均为阴性。     

猪肺炎支原体PCR诊断方法的建立

建立了一个PCR检测猪肺炎支原体(Mhp)的方法。根据国外发表Mhp 16sr RNA基因设计了一对特异性引物，扩增出一个大小为653bp的特异性片段。将PCR产物克隆并测序表明，与GenBank的Mhp的序列的同源性为89．2％。而对于常见的猪呼吸道疾病有关的病原胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌以及牛支原体、羊支原体不能扩增出特异性片段；PCR的敏感性实验显示这对引物能够检测到1ng的DNA，结果表明此方法特异、敏感。     

兔传染性鼻炎的诊治

从某兔场疑似兔传染性鼻炎病例采集病料进行细菌分离鉴定,分离到多杀性巴氏杆菌及支气管败血波氏杆菌两种细菌,并对其进行了药敏试验,筛选出敏感药物进行治疗,取得了良好效果,并提出了预防的建议.     

精料中补充氨基酸及保护处理对奶牛营养物质降解率的影响

猪传染性萎缩性鼻炎是由支气管败血波氏杆菌或／和产毒性多杀性巴氏杆菌感染而引起的猪的一种慢性呼吸道传染病。以慢性鼻炎、颜面部变形、鼻甲骨萎缩、鼻衄、流泪以及生长发育迟缓为特征。该病的病原体是Ⅰ相支气管败血波氏杆菌和产毒性多杀性巴氏杆菌D型，偶尔为A型；单独感染支气管败血波氏杆菌引起较温和的非进行性鼻甲骨萎缩，感染支气管败血波氏杆菌后继发产毒性多杀性巴氏杆菌时。     

联合检测兔巴氏杆菌和波氏杆菌病血清抗体的Dot-ELISA方法研究

兔多杀性巴氏杆菌病(Pm)和兔支气管败血波氏杆菌病(Bb)是家兔的两种主要细菌性传染病。兔波氏杆菌病可引起家兔的慢性鼻炎,兔巴氏杆菌病也可引起包括呼吸道在内的多种疾病。试验旨在建立一种简便、快速、经济、准确的联合检测Pm和Bb抗体水平的方法,可用于这两种疾病的免疫监测及流行病学调查。1材料1.1菌种兔巴氏杆菌Pm90株、兔支气管败血波氏杆菌Bb82株,为山东省农业科学院畜牧兽医研究所分离保存[1]。1.2血清大肠杆菌多因子血清、沙门菌多因子血清,购自中国兽药监察所;魏氏梭菌、兔瘟、Pm和Bb阳性血清,山东省农业科学院畜牧兽医研究所…     

地高辛标记探针检测猪胸膜肺炎放线杆菌的研究与应用

利用PCR反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650 bp的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102 个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。     

家兔支气管败血波氏杆菌的简易鉴定法

兔鼻炎是兔病中较常见的疾病,引起鼻炎的病原体比较复杂,据Spanoghe等(1978)的调查32个有呼吸道疾病的兔场,感染支气管败血波氏杆菌与多杀性巴氏杆菌的有19个兔场,有呼吸道炎症的家兔占31.3%,支气管败血波氏杆菌的检出率为     

兔源A型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种特异性强且敏感性高的兔源A型多杀性巴氏杆菌快速检测方法，本研究以兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因为目的基因，设计2对特异性引物进行双重PCR扩增，经反应条件优化，建立检测兔源A型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法。该方法的最佳退火温度为57.8℃，最佳混合引物浓度为0.8μmol/L。该方法特异性强，对兔源A型多杀性巴氏杆菌为kmt1和hyaD基因双阳性，对兔源D型和F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因单阳性，对兔源其它细菌性病原和阴性对照则均为阴性。该方法敏感性高，对兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因的最低检出限分别为1×10³拷贝/μL和1×10⁴拷贝/μL。该方法重复性好，且与已报道的多重PCR方法的符合率高达96.12%。本研究建立的双重PCR方法对兔源A型多杀性巴氏杆菌具有良好的特异性和敏感性，且重复性好、准确性高，为该病原的快速检测提供了有力的技术支持。     

我国家兔危害严重疫病流行现状调查

2008～2010年期间,在我国华东、西南、东北、华南、华北、华中主要家兔养殖地区,调查兔场118个,存栏兔累计约126.56万只,对危害家兔生产严重的兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、支气管败血波氏杆菌病、产气荚膜梭菌病、球虫病、皮肤螨虫病、皮肤真菌病等疾病流行现状进行了调查。结果表明:兔病毒性出血症、支气管败血波氏杆菌病、产气荚膜梭菌病、得到了较好的控制,球虫病还存在一定的发病率,多杀性巴氏杆菌病和皮肤真菌病的发病率较高。