新吉细毛羊KAP24.1基因多态性及羊毛性状的相关性分析

为了解角蛋白关联蛋白(KAP)24.1基因在新吉细毛羊群体中的多态性与其毛用性状的关联性,试验采用DNA测序法对新吉细毛羊基因组编码区进行测序,找出基因突变位点,然后采用PCRSSCP技术对497只新吉细毛羊KAP24.1基因编码区序列进行多态性分析,并利用最小二乘模型对其多态性与产毛量、纤维直径、拉伸长度进行关联性分析。结果表明:在编码区有两处突变点,一处在348 bp处发生C→T的突变,脯氨酸突变为亮氨酸;另一处在414 bp处发生T→C的突变,丝氨酸突变为脯氨酸,均属于错义突变,KAP24.1基因的AA、AB、BB和CC基因型与纤维直径不相关(P0.05),BB基因型的产毛量和拉伸长度显著大于AB基因型、CC基因型(P0.05)。说明KAP24.1基因可以作为新吉细毛羊产毛量和拉伸长度主要候选基因之一,BB基因型可以作为分子标记用于预测绵羊产毛量和拉伸长度。     

不同绵羊群体间心脏型脂肪酸结合蛋白基因第2外显子单核苷酸多态性的研究

以东北细毛羊、小尾寒羊、杜泊和道赛特4个群体为研究对象,采用PCR-SSCP方法对心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein,H-FABP)基因第2外显子单核苷酸多态性进行检测。结果发现,H-FABP基因第2外显子存在939(A/G)、980(G/A)、1013(A/C)和1018(T/C)4个SNP位点,表现出AA、AB、BB 3种基因型;在东北细毛羊、小尾寒羊和杜泊群体中,BB型为优势基因型,在道赛特群体中,AB型为优势基因型;经χ²检验后,4个绵羊品种群体的基因频率和基因型频率均处于Hardy-Weinberg平衡状态;群体遗传多态性分析结果表明,东北细毛羊、杜泊和道赛特3个群体中的多态信息含量(PIC)均处于0.25和0.50之间,为中度多态,小尾寒羊为低度多态(PIC＜0.25);进一步分析结果表明,各个群体存在不同程度的遗传变异。     

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。     

孕酮受体基因外显子 4作为小尾寒羊多胎候选基因的研究

试验采用53只小尾寒羊母羊（山东梁山和泰安）、25 只无角陶赛特羊母羊（甘肃永昌肉用种羊场）、35只蒙古羊母羊（甘肃武威）。分别采集颈静脉血样提取DNA,利用GenBank中人孕酮受体基因外显子4和绵羊孕酮受体基因 mRNA序列,设计绵羊孕酮受体基因外显子4限制性片段特异性引物,进行PCR扩增,对其PCR产物克隆、测序验证。用PCR-SSCP检测多态性,通过DNA测序确定单核苷酸多态位点（SNPs）。经过研究分析表明,小尾寒羊由野生型AA型、杂合AB型、突变纯合BB型3种基因型组成,蒙古羊由AA型、AB型两种基因型组成,无角陶赛特羊只有AA型一种基因型,不存在突变;在基因型分布上小尾寒羊与无角陶赛特羊和蒙古羊之间存在极显著差异（P<0.01）,而无角陶赛特羊和蒙古羊之间差异不显著（P>0.05）;小尾寒羊突变纯合基因型BB和杂合AB中存在4个突变位点,此外在发现的4个突变位点中,只有第4个突变位点246碱基T→C引起氨基酸突变。      

小尾寒羊及其杂种后代BMPR-IB基因遗传效应研究

以骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)基因为小尾寒羊及其与波德代羊、白萨福克羊、无角陶赛特羊杂交后代多胎性能的候选基因,采用PCR-SSCP技术检测该基因分别在11个绵羊群体中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明:小尾寒羊和低代杂种后代在BMPR-IB基因编码序列第746位碱基处发生了Q249R突变,小尾寒羊AA、AB和BB的基因型频率分别为0.032 3,0.225 8和0.741 9,B等位基因频率为0.854 8,A等位基因频率为0.145 2。小尾寒羊杂种后代群体中B等位基因频率随杂交代数的增加而降低,而A等位基因频率却随杂交代数的增加而增加。因此,BMPR-IB基因是影响小尾寒羊及其低代杂种后代高繁性能的一个主效基因,可以用于对绵羊产羔数的辅助选择,并进行横交固定培育多胎新品系。     

小尾寒羊高繁殖力候选基因RBP4的研究

以视黄醇结合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）基因为候选基因，采用PCR-SSCP技术分析了RBP4基因在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）以及低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、萨福克羊）中的单核苷酸多态性，同时研究这个基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：RBP4基因扩增片段在4个绵羊品种中存在PCR-SSCP多态性。BB基因型只出现在高繁殖力绵羊品种中，而低繁殖力绵羊品种则没有BB基因型；AB基因型频率随着绵羊繁殖力的降低而升高；AA基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊中。BB基因型小尾寒羊产羔数分别比AA和AB基因型多0．52只（Pd0．05）和0．67只（Pd0．05），AA和AB基因型小尾寒羊产羔数没有显著差异（P〉0．05）。本研究检测的绵羊RBP4基因座位与小尾寒羊高繁殖力相关。     

绵羊MyoG基因外显子的单核苷酸多态性群体遗传学分析

采用PCR—SSCP技术分析了肌细胞生成素（MyoG）基因外显子1、2在蒙古羊、无角陶赛特羊、德国肉用美利奴羊和白萨福克羊这4个绵羊品种的多态性。结果表明在在外显子1（exonⅠ）所扩增的片段中存在3种基因型（AA型、AB型和BB型），在外显子2（exonⅡ）所扩增的片段中不存在多态性。对于exonⅠ扩增片段，4个绵羊品种均检测到AA和AB基因型；BB基因型只在蒙古羊、陶赛特羊和白萨福克羊中检测到。在4个绵羊品种中，蒙古羊的AA基因型频率最高，而其它3个品种羊是AB基因型频率高；A等位基因频率明显高于B等位基因频率。exonⅠ的多态性片段测序分析表明：MyoG基因第305处发生了单碱基突变（T→C），并导致了所编码氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸。     

绵羊MyoG基因内含子Ⅱ多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】 分析肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因内含子Ⅱ的多态性及其对绵羊生长性状的影响,筛选对绵羊生长发育有显著影响的分子标记,以期为绵羊的分子育种提供参考。【方法】 选取大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊5种绵羊为研究对象,采用PCR-RFLP技术对MyoG基因内含子Ⅱ(Eco72 Ⅰ)进行基因分型,利用PopGene32软件计算绵羊MyoG基因内含子Ⅱ的群体遗传多样性,利用SPSS 17.0软件对不同基因型与绵羊生长性状进行关联分析。【结果】 小尾寒羊、杜泊羊、湖羊群体中MyoG基因内含子Ⅱ均存在3种基因型:AA(368/540 bp)、AB(908/368/540 bp)和BB(908 bp);大尾寒羊和豫西脂尾羊群体中仅检测到2种基因型:AB(908/368/540 bp)和BB(908 bp)。大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊的AB基因型频率分别为0.845、0.633、0.917、0.706和0.811,BB基因型频率分别为0.155、0.033、0.083、0.176和0.054,AA基因型频率分别为0、0.333、0、0.118和0.135。小尾寒羊的杂合度最低(0.455),杜泊羊的杂合度最高(0.497),表明杜泊羊的遗传多样性要高于其他群体;5个群体多态信息含量(PIC)均为中度多态(0.25<PIC<0.5)。关联分析发现,小尾寒羊MyoG基因内含子Ⅱ BB基因型个体胸围、胸宽、头长、颈长均显著低于AA、AB基因型(P<0.05)。【结论】 MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点可作为影响绵羊生长性状的分子标记,结果可为今后绵羊生长性状的分子标记辅助选择提供参考。     

FSHβ基因CDS区遗传特征及其与小尾寒羊产羔数关系的研究

选择小尾寒羊等5个绵羊群体为研究对象,采用PCR-SSCP和克隆测序等分析方法,检测促卵泡素β(FSHβ)基因CDS区的单核苷酸多态性,并分析其对小尾寒羊产羔数的遗传效应。结果表明:FSHβ基因CDS区第2外显子存在多态性,在5个绵羊群体中都表现出AA、AB和BB3种基因型。BB型第147位发生T→C的单碱基同义突变。高产羔数的小尾寒羊与甘肃高山细毛羊、特克塞尔羊、陶蒙杂种羊之间的基因型分布差异明显(P0.01)。5个绵羊群体均处于中度多态(0.25PIC0.5)。固定效应分析结果表明,场-年-季对小尾寒羊产羔数无影响(P0.05),胎次和基因型均影响产羔数(P0.05)。AA型小尾寒羊产羔数最小二乘均值比AB型的多0.77只(P0.05),比BB型的多0.74只(P0.05)。研究表明,FSHβ基因可能是控制小尾寒羊产羔数的一个主效基因或与之存在紧密连锁的一个分子遗传标记。     

河南地方绵羊品种LHR基因的多态性分析

本研究采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析方法检测3个绵羊的促黄体素受体(LHR)基因第11外显子的多态性.结果表明,促黄体素受体(LHR)外显子11在小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊中存在3种基因型,记为AA、BB和AB.小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊的AA、BB和AB基因型频率分别为:0.045、0、0.174;0.659、0.902、0.565;0.295、0.098、0.261.测序结果发现,不同基因型之间有5个位点发生突变,其中在37位发生G、A突变;在49位发生T、C突变;在93位发生T、C突变;在139位发生T、G突变;在184位发生A、G突变.     

6个绵羊群体BMP15、GDF9基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊、中国美利奴羊(无角型)、东北细毛羊、杜×寒杂交羊(F1)、杜×寒杂交羊(F3)、白头杜泊羊6个绵羊群体骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)、生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因的多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以6个绵羊群体共378只个体为研究对象,利用PCR-SSCP技术检测BMP15、GDF9基因多态性;用DNAStar软件与I-TASSER软件预测蛋白质二级结构和三级结构;计算基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡、杂合度(He)、纯合度(Ho)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。运用GraphPad Prism 6软件对新吉细毛羊群体BMP15基因多态性与产羔数进行相关性分析。结果显示,BMP15基因P1引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型:AA、AC、CC,该突变为BMP15基因外显子1上58-60bp 3个碱基(CTT)缺失,新吉细毛羊、杜×寒杂交羊(F3)、白头杜泊羊的χ~2值均达到显著水平,处于Hardy-Weinberg不平衡状态,不同基因型间新吉细毛羊平均产羔数差异均不显著(P0.05);GDF9基因P2引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型:DD、DE、EE,其中新吉细毛羊仅有1种基因型:DD,该突变为GDF9基因外显子2上477bp处T→C的转换,该突变未导致氨基酸的改变,除新吉细毛羊外其余5个群体χ~2值均未达到显著水平,处于Hardy-Weinberg平衡状态,说明GDF9基因T477C突变不能作为新吉细毛羊多胎性状遗传标记位点。     

6个绵羊群体BMP15、GDF9基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊、中国美利奴羊（无角型）、东北细毛羊、杜×寒杂交羊（F1）、杜×寒杂交羊（F3）、白头杜泊羊6个绵羊群体骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）、生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因的多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以6个绵羊群体共378只个体为研究对象,利用PCR-SSCP技术检测BMP15、GDF9基因多态性;用DNAStar软件与I-TASSER软件预测蛋白质二级结构和三级结构;计算基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡、杂合度（He）、纯合度（Ho）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）。运用GraphPad Prism 6软件对新吉细毛羊群体BMP15基因多态性与产羔数进行相关性分析。结果显示,BMP15基因P1引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型：AA、AC、CC,该突变为BMP15基因外显子1上58-60 bp 3个碱基（CTT）缺失,新吉细毛羊、杜×寒杂交羊（F3）、白头杜泊羊的χ²值均达到显著水平,处于Hardy-Weinberg不平衡状态,不同基因型间新吉细毛羊平均产羔数差异均不显著（P>0.05）;GDF9基因P2引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型：DD、DE、EE,其中新吉细毛羊仅有1种基因型：DD,该突变为GDF9基因外显子2上477 bp处T→C的转换,该突变未导致氨基酸的改变,除新吉细毛羊外其余5个群体χ²值均未达到显著水平,处于Hardy-Weinberg平衡状态,说明GDF9基因T477C突变不能作为新吉细毛羊多胎性状遗传标记位点。     

绵羊KAP8-1基因克隆与表达分析

本文旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8-1(KAP8-1)基因c DNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR法克隆KAP8-1基因,定量RT-PCR方法分析2个品种间KAP8-1基因的表达谱差异。结果表明:已成功克隆出绵羊KAP8-1基因,该基因片段长225 bp,其中ORF区189 bp,编码62个氨基酸,分析显示该KAP8-1基因属于典型的HGT KAP家族,甘氨酸和酪氨酸含量分别为22.6%和17.7%;小尾寒羊与新吉细毛羊间存在丰富的多态性,且多态位点均引起关键性氨基酸的突变;组织表达谱检测表明KAP8-1基因为多组织表达基因,小尾寒羊与新吉细毛羊中不同组织表达谱丰度存在显著差异,表现为小尾寒羊脾脏、肝脏中高表达,而新吉细毛羊则皮肤、心脏中高表达。结果显示,小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8-1基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因可能与毛表型性状密切相关。     

不同绵羊品种GHSR基因多态性与生长性状的关联分析

以GHSR基因为候选基因,随机选取滩羊、小尾寒羊和兰州大尾羊3个品种共计1 249个个体为试验材料,利用DNA池测序结合琼脂糖凝胶电泳方法,检测突变多态性,分析其与体重、生长性状的相关性。试验结果表明,在GHSR基因的第一内含子上存在24 bp的插入/缺失突变,3个绵羊品种中均存在AA、AB、BB 3种基因型。该位点的多态性与3种绵羊8个生长性状指标关联分析显示,兰州大尾羊BB基因型的个体体重显著高于其他基因型;AB基因型的个体体高、十字部高显著高于其他基因型;小尾寒羊AB基因型的个体胸宽显著高于其他基因型;AA基因型的个体体高、十字部高显著高于BB基因型;滩羊AB基因型的个体体斜长、体重显著高于AA基因型,BB基因型的个体体高显著低于其他基因型。研究表明:GHSR基因可以作为3种绵羊生长性状的候选基因,为绵羊育种选育提供新思路。     

藏系绵羊KAP3.2基因多态性及其对部分经济性状的影响

采用PCR-SSCP和DNA测序技术,对高原型、欧拉型和乔科型3个类型共254只藏绵羊KAP3.2基因的部分序列进行多态性分析,并利用最小二乘线性模型研究了其多态性与体质量、毛长和产毛量性状的关联性。结果,3个群体藏绵羊在KAP3.2基因座上均检测到AA、AB和BB 3种基因型,高原型以A等位基因为主,欧拉型和乔科型以B等位基因为主。3个群体基因型频率均处于Hardy-Weinberg非平衡状态,高原型和欧拉型达中度多态,乔科型为低度多态。测序表明KAP3.2基因271 bp处存在1个C→T的突变,属同义突变。体质量性状上,3类藏绵羊各基因型间均差异不显著;毛长性状上,3类藏绵羊AA基因型均显著高于BB型(P<0.05或P<0.01),而与AB型间无显著差异;产毛量性状上,3类藏绵羊AA基因型均显著高于BB和AB型(P<0.05)。结果表明,KAP3.2基因可作为影响藏系绵羊毛长和产毛量性状的分子标记。     

小尾寒羊KAP6.4基因PCR-SSCP分析

KAP6.4是角蛋白关联蛋白KAP基因家族中的一员。为探究小尾寒羊中KAP6.4基因是否存在多态性,试验通过提取小尾寒羊血液样品DNA,利用PCR-SSCP技术检测KAP6.4基因的SNP多态。试验检测到2种基因型,其中AA(基因型频率为0.778)为优势基因型,A(等位基因频率为0.889)为优势等位基因。测序结果显示,AA型基因和Gen Bank登陆序列相一致,AB型基因在编码区发生了7处碱基突变和增添36 bp片段。分析表明,AB型变异造成了3个氨基酸残基的变化。以上结果表明,KAP6.4基因在小尾寒羊群体中存在多态性,这为进一步在小尾寒羊群体中开展绒毛性状与KAP6.4基因多态性的关联分析提供依据。     

新吉细毛羊5个生殖激素受体基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊促性腺激素释放激素(GnRHR)、促黄体素(LHR)、促卵泡素(FSHR)、催乳素受体(PRLR)、雌激素(ESR)5个生殖激素受体基因多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以119只新吉细毛羊个体为研究对象,利用ABI测序仪检测基因多态性;用DNASTAR软件与I-TASSER软件预测蛋白质三级结构;用Excel计算基因型频率;用GraphPad prism 6软件进行新吉细毛羊群体5个生殖激素受体基因多态性与产羔数的相关性分析。经测序分析发现,FSHR基因不存在突变位点,其余4个基因存在13个突变位点。GnRHR基因存在A505G、G720C突变,LHR基因存在T1262G、A1991G、C2012T、A2032T、T2041A的突变,PRLR基因存在A1263G、C1544G突变,ESR基因存在A106T、C181T、G612A、C735T突变。在新吉细毛羊群体4个基因多态性与产羔数相关性分析结果中,只有ESR基因A106T突变对新吉细毛羊产羔数影响显著。其中AA、AT、TT 3种基因型个体的平均产羔数分别为1.391、1.101、1.417。AA基因型、TT基因型平均产羔数比AT基因型分别多0.290、0.316个(P<0.05)。AA基因型、TT基因型平均产羔数之间差异不显著(P>0.05)。     

高原型藏绵羊KAP基因单核苷酸多态性分析

试验旨在寻找角蛋白辅助蛋白(keratin-associated proteins,KAP)基因与产毛性状相关的多态位点,为藏绵羊产毛性状的分子标记提供理论依据。采用PCR-SSCP技术对高原型藏绵羊角蛋白辅助蛋白基因家族中KAP3.2、KAP7基因部分序列和KAP8基因外显子进行多态性分析。结果表明,3个基因座都存在多态性,均检测到AA、AB和BB 3种基因型。KAP3.2基因以A等位基因为优势等位基因,AA基因型为优势等位基因型;KAP7和KAP8基因均以B等位基因为优势等位基因,BB基因型为优势等位基因型。高原型藏绵羊在KAP3.2和KAP8基因座达中度多态,而在KAP7基因座为低度多态,在KAP3.2和KAP8位点上基因型频率处于Hardy-Weinberg非平衡状态。测序分析结果表明,KAP3.2和KAP8基因上分别存在1个C→T(271 bp)和1个T→C(1122 bp)的突变,均属于同义突变,KAP7基因5′调控区存在1个T→C(102 bp)的突变。     

绵羊高繁殖力候选基因BMPR-IA的研究

以骨形态发生蛋白受体IA（bone morphogenetic protein receptor IA，BMPR-IA）基因为候选基因，采用PCR—SSCP技术检测该基因在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）以及低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、特克塞尔羊、德国肉用美利奴羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：在小尾寒羊中检测到AA、AB两种基因型，在湖羊中只检测到一种基因型BB，而在低繁殖力的3个绵羊品种中只检测到一种基因型AA。统计结果表明：小尾寒羊A等位基因频率为0．964，B等位基因频率为0．036。测序结果表明：BB型与AA型相比有6处核苷酸发生了突变。独立性检验表明：外尾寒羊与低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异不显著（P〉0．05），而湖羊与小尾寒羊、低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异极显著（P〈0．001）。AB基因型小尾寒羊平均产羔数比AA基因型多0．15只，但差异不显著（P〉0．05）。研究表明：BMPR-IA基因不是小尾寒羊和湖羊高繁殖力的主效基因。     

绵羊角蛋白关联蛋白8.2基因克隆与表达分析

本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574bp,其中ORF区192bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3′UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。