脉冲电泳技术及其在食用菌研究中的应用

脉冲电泳是一种可用于分离20Kb到10Mb大分子量DNA的新型凝胶电泳技术,已应用于双孢蘑菇,香菇、侧耳、草菇等多种食用菌的核型分析及核型多态性的研究。本文介绍了真菌电泳核型分析的基本操作程序和主要影响因素,并阐述了脉冲电泳在食用菌种群特异性鉴定、染色体作图和遗传分析等方面的应用前景。     

国际马铃薯和番茄基因组测序进展

 国际番茄基因组项目计划精细测定220 Mb的常染色质区域,马铃薯基因组项目计划测定全基因组840 Mb的DNA序列。中国是两个项目的参与国,负责番茄染色体III,XI和马铃薯染色体X,XI的测序工作。基于番茄和马铃薯基因组间存在着高度的相似性,在二者染色体XI的测序的同时运用了比较测序的方法。     

草菇噬菌体基因文库的构建

采用CTAB/NaCl法提取草菇基因组DNA,通过限制性内切酶Sau 3AI对纯化的草菇基因组DNA进行部分酶切,获得大小为20kb左右的DNA片段.这些DNA片段再次纯化后,与经Eco R I和Bam H I双酶切消化的Lambda GEM-11噬菌体DNA载体臂相连,以大肠杆菌(E.coli)LE392为寄主细胞,构建了草菇(Volvariella volvacea)基因文库,所构建基因文库效价为1.5×105 pfu/mL.     

草菇全基因组框架图

采用Roche 454 GS FLX测序技术和Solexa测序技术相结合,进行了草菇(Volvariella volvacea)全基因组的测序,最终获得了长度为35.67Mb的草菇全基因组序列。通过生物信息学预测,获得了11097个蛋白编码基因,其中5516个基因有明确的功能注释信息。这是在国际上首次报道的草菇基因组框架图。     

广东省草菇主要栽培菌株RAPD多态性分析

利用RAPD标记对广东省8个草菇主要栽培菌株的亲缘关系和遗传多样性进行研究,获得了草菇不同菌株的DNA指纹图谱。分子聚类结果表明,8个供试菌株可分成两组：菌株V17、V844和粤草01为一组;粤草02、粤草03、粤草04、V5-1和V23为另一组,且同一组内的DNA多态性也有差异。RAPD扩增指纹能有效分辨不同菌株的基因型,可为草菇商业菌株的鉴别提供快速有效的技术手段,为规范食用菌菌种生产管理提供科学依据。     

草菇基因文库的构建(英文)

应用基因重细技术,我们建立丁一个草菇总DNA的部分基因文库。通过限制性内切酶Sau 3AI部分酶切纯化的草菇总DNA,得到小于4kb的DNA片段。这些DNA片段插入到经Bam HI酶切及碱性磷酶酯酶处理的pUC18质粒,转化感受态细胞DH5α。在此研究中。我们比较了两种转化方法(氯化钙转化法和电转化法)的转化效率,电转化法的转化效率高于氯化钙转化法数千倍,达到2×10(2)CFU/μg DNA。在此实验中DNA重组率是64%,这个草菇总DNA的部分基因文库由8000个克隆组成,平均每个克隆含有1.5kb的草菇DNA。此基因文库含有15%的草菇总DNA。可作为分子标记用于DNA指纹图谱分析及作为遗传学标记用于RFLPs的遗传图谱分析。     

真菌完整染色体DNA的几种不同制备方法

系统地介绍了目前用于真菌电泳核型分析的真菌完整染色体DNA的7种制备方法，并讨论了各种方法在真菌中应用的优缺点，为真菌电泳核型分析提供技术基础。     

结球甘蓝染色体片段替换系构建

以结球甘蓝(Brassica oleracea L. var. capitata)育种骨干亲本R2-P2(圆球形,抽薹晚,硫苷含量低,高感黑腐病、枯萎病和霜霉病)为轮回亲本,以野生甘蓝自交系R4-P1(不结球,抽薹早,蜡质厚,硫苷含量高,对黑腐病、枯萎病和霜霉病等多种病害具有抗性)为供体亲本,通过连续回交、自交和分子标记辅助选择,构建出一套由163个具有R2-P2遗传背景且具有R4-P1供体染色体片段单株组成的染色体片段替换系(Chromosome segment substitution line)。该替换系群体具有102个染色体替换片段,均匀分布在1～9号染色体上,平均每个株系携带1.3个染色体片段,平均替换长度为5.62 Mb。替换片段总长度为573.74 Mb,覆盖亲本R4-P1全基因组的73.4%,其中单片段替换片段总长度为139.91 Mb,覆盖全基因组的26.5%,双片段替换片段总长231.41Mb,覆盖亲本R4-P1全基因组的43.82%,含有3个替换片段总长度为201.3 Mb,覆盖供体亲本基因组25.98%。     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的克隆和序列分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(SAHH)全长cDNA序列设计引物,以草菇基因组DNA为模板,PCR扩增获得草菇SAHH基因的全长序列,序列分析结果表明,草菇SAHH长度为1868bp,编码430个氨基酸残基,基因由12个外显子和11个内含子组成,将草菇SAHH基因推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH基因氨基酸序列进行比较发现,SAHH基因保守性较高。     

黄芪多糖在草菇冷藏保鲜中的应用

分析4℃处理24、48 h的草菇（Volvariella volvacea）渗出液代谢组；用200μmol·L-1黄芪多糖溶液浸泡草菇后在4℃放置24、48 h，测定草菇β-葡萄糖苷酶活性和转录组，检测糖基转移酶基因VVO＿02307表达量。结果表明：4℃处理24、48 h草菇渗出液代谢组分明显不同；与4℃处理24 h草菇比较，处理48 h的草菇中蔗糖含量较低，亚油酸含量较高。与对照比较，黄芪多糖溶液浸泡的草菇在4℃处理24 h时自溶不明显，β-葡萄糖苷酶活性显著降低。转录组分析结果显示，黄芪多糖增强草菇对低温胁迫的耐受性，可能是通过提高N-聚糖生物合成通路活力实现的。研究结果可为草菇低温保鲜技术研发提供参考。     

草菇蛋白酶的鉴定

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一，属于典型高温真菌。低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解；造成草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。在分离、纯化草菇蛋白酶的基础上，采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白酶的分子量为23KD，并测定了蛋白酶不同温度下的活性变化曲线，为草菇低温自溶与蛋白酶之间关系 的研究奠定了基础。     

25株草菇菌株的遗传多样性

为选育出更多适于寒区生产的草菇菌株,从6个草菇生产省引进了25株草菇(Volvariella volvace)菌株,利用表观形态与ISSR分子标记相结合技术对不同来源的草菇菌株进行遗传多样性分析。结果表明,利用c PDA培养基,在30℃恒温培养条件下,依据草菇的表观形态将25个供试草菇菌株划分成4个组群。利用ISSR分子标记聚类分析,相似水平在0.90时可将25个供试草菇菌株细分为8个组群。18号菌株在2种鉴别方法上的归类有差异,有待于栽培农艺性状进一步验证。     

草菇组织分离物的遗传变异研究（Ⅱ）

利用现代分子生物学技术扩增获得草菇组织分离物与草菇出发菌株的ＲＡＰＤ和ＩＴＳ的ＤＮＡ指纹图谱，以此估算两者的ＤＮＡ相似系数，并构建了遗传相关聚类图。结果表明，两者存在着一定的遗传差异。     

草菇菌种保藏效果鉴定的研究

通过对34株草菇[Volvariella volvacea(Bull.ex Fr.)Sing.]保藏菌种的肉眼和显微观察,按菌落和菌丝形态,将其分为气生型(正常)和匍匐型(不正常)两大基本类型。气生型又分为正常生长型和缓慢生长型两类。本实验观察到,所有气生型菌株的菌丝都粗而直,在PDAY培养基上正常生长的都能在天然基质废棉上正常生长并出菇;而所有在PDAY培养基上生长缓慢的都不能在天然基质废棉上正常生长(或生长缓慢细弱,或仅在表面生长),且不能出菇。所有匍匐型菌株的菌丝都细而多弯曲,在PDAY培养基和废棉上都生长缓慢,甚至不能生长,均不能出菇。凝胶电泳表明,与气生型菌株相比,匍匐型菌株多1-2条酯酶同工酶带,而缺少一条活性极强的可溶性蛋白带。实验结果表明,(1) 菌落形态特征可能是鉴定草菇菌种保藏效果的第一特征,气生菌丝的有无可以作为菌株正常与否的重要标志;(2) 菌丝形态,包括粗细、曲直、分枝等是区别草菇菌种保藏后正常与否的微观特征;(3) 酯酶同工酶谱和可溶性蛋白带是鉴别草菇菌种保藏效果的可利用的生化标志。上述特征和标志都与草菇菌种的商业性状,如发菌、出菇等,有明显的关系。对于这些生化标志尚有待于进一步鉴定和研究     

草菇蛋白酶的分离与纯化

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一,属于典型的高温真菌,低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解,导致草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。草菇子实体经破碎、(NH_4)_2SO_4分步沉淀、Sephadex G-150凝胶过滤,获得草菇蛋白酶样品,为草菇的低温自溶与蛋白酶之间关系的研究奠定了基础。     

微波处理与涂膜对草菇控温贮藏保鲜的影响研究

探讨了微波杀菌、壳聚糖和黄原胶涂膜对草菇控温贮藏保鲜的影响.采用单因素试验比较不同加热火力、加热时间微波杀菌和不同配比壳聚糖、黄原胶涂膜的草菇保鲜效果,再根据单因素优选试验结果,选取微波时间、子实体包装规格、涂膜剂浓度(壳聚糖和黄原胶共混涂膜剂浓度)和贮藏温度为主要因素,以鲜度感观评分为指标,先微波后涂膜进行正交试验.结果表明,输出功率462 W微波加热15 s 或20 s对草菇具有较好的杀菌保鲜效果;涂膜处理保鲜效果均显著优于对照组;优化保鲜工艺:包装规格150 g,微波(462 W)处理时间20 s,涂膜剂浓度2.0%(壳聚糖∶黄原胶=1∶1)和贮藏温度15 ℃,在此优化条件下,草菇贮藏保鲜达216 h以上(＞9 d).     

低温影响草菇蛋白质组分变化的研究

应用凝胶电泳技术测定４℃下处理的草菇及其菌丝体，发现大分子量的蛋白质组分有所减少，小分子量的蛋白质组分有所增加。从蛋白质变化角度来看，草基在低温下变软、液化直至腐败的过程是草菇体内蛋白质降解的过程。     

数字基因表达谱解析草菇子实体的生长发育

为筛选出与草菇子实体发育相关的转录因子,以不同发育时期的草菇子实体为试材,利用数字基因表达谱对不同发育时期的基因进行表达分析。结果表明:获得8个差异表达的Homeobox转录因子,其中5个在草菇原基期阶段上调表达,3个在伸长期阶段下调表达。这些差异表达的转录因子可能参与草菇子实体不同发育阶段的形态建成。     

外源DNA片段导入草菇原生质体的研究

以平菇DNA为供体,草菇原生质体为受体,用PEG,CaCl_2作诱导剂,将平菇DNA导入草菇原生质体,选育出V_(157-1)菌株,该菌株在菇型、温型、酶活力及生物转化率上与亲本V_(157)有显著差异。本研究为食用菌育种提供了一条新的途径。