新城疫病毒（青岛株）F蛋白基因的克隆和序列分析

参考新城疫病毒（NDV）长春株的F基因序列设计了1以特异性引物，应用RT－PCR对NDV青岛株（野毒）的F基因进行了扩增，扩增产物克隆后测序，扩出的F基因核苷酸长度为792bp，编码261个氨基酸，包括完整的F2片段和部分F1片段，裂解位点区（112－117aa）氨基酸序列为Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe，与国外发表的强毒株序列相符，正明青岛株为强毒株，根据该基因推导的所基酸序列，与国内外发表的NDVF蛋白氨基酸序列相比，同源性为88．1％－94．3％。     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2对引物，对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定，其基因序列全长均为1662bp，编码553个氨基酸，均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV参考株的F基因序列进行了比较。结果表明，核苷酸序列的同源性为82．6％～98．1％，氨基酸的同源性为87．7％～98．7％。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(^112R—R—Q—K／R—R—F^117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明，10株NDV广西分离株中GX1／00、GX2／00、GX4／00、GX6／02、GX7／02、GX9／03、GX10／03和GX11／03为基因Ⅶd亚型，GX3／00和GX5／00为基因Ⅲ型。     

NDV 江苏分离株F基因的克隆与序列分析

为比较NDV江苏分离株的遗传变异特征,应用RT-PCR扩增出新城疫病毒（NDV）江苏徐州株（JSXZ）、江苏宿州株（JSSZ）、江苏连云港株（JSLYG）和江苏淮安株（JSHA）的融合蛋白F基因的全长核苷酸,将其分别克隆至pMD18-T载体中。将获得的阳性重组质粒进行序列测定后,推导出其氨基酸序列,进行分析和比较。结果表明,所获得的4个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1662bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;4个毒株与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有69．3％～80．8％。JSXZ株和JSSZ株F基因的裂解位点为112-RRQK／RRF-117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征。以lbp～374bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,JSXZ和JSSZ株NDV为基因Ⅷ型,JSLYG和JSHA株NDV为基因Ⅸ型。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因的克隆与毒力分析

通过RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒(NDV)山东分离株(ShD-5-04)的F基因序列,对其进行核苷酸序列测定和分析.结果表明,ShD-5-04株的F基因开放性阅读框为1 662 bp,编码489个氨基酸.与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;F蛋白裂解位点区(112位～117位)氨基酸组成与强毒株一致,从基因水平上说明NDV ShD-5-04株为新城疫强毒株.     

黑龙江省和河北省鸡新城疫病毒分离株的遗传变异分析

利用RT—PCR技术扩增出了4株NDV分离株(HeB—4—99，Hed—5—99、HeB—6—02和HLJ—10—02)F基因539bp的片段，将该片段克隆到pMD18-T载体上。经酶切分析、质粒PCR鉴定及核苷酸序列测定，成功获得了4株NDV分离株F基因部分片段的重组质粒。同源性分析显示，4株分离毒株的核苷酸序列具有95．9％～100％的同源性，与LaSota的核苷酸序列同源性为81．09／6～81．8％，与F48E9的核苷酸序列同源性达85．8％～89．3％。推导氨基酸序列分析表明，4个毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为^112RRQKRF^117，具有强毒株裂解位点氨基酸组成特点，与ICPI和MDT测定结果相吻合。73株NDV毒株的系统发育进化树分析表明，HeB—4—99、HeB—5—99、HeB—6—02和HLJ—10—02均归属于基因Ⅶ型。     

新城疫病毒鹌鹑分离株融合蛋白基因的克隆与序列分析

本研究以一株从自然发生新城疫病死的鹌鹑中所分离到的新城疫病毒（QNDV／89）为研究对象,用反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）对QNDV／89株的F全基因进行分段扩增、定向克隆到pUC119载体后,采用Sanger’s双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列,并推导出相应氨基酸序列。QNDV／89株F基因全长1662bp,单一的开放阅读框编码553个氨基酸的多肽,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-R-R-F117,是NDV强毒株所特有的序列结构,这与其生物学特性及致病性实验结果是相一致的。序列分析结果表明,QNDV／89株与F48E9株的核苷酸同源率高达99.22％,氨基酸的同源率为98.37％;而与弱毒株LaSota的核苷酸同源率为88.93％,氨基酸的同源率为90.42％。本研究首次报道了流行于我国鹌鹑中的新城疫强毒融合蛋白基因序列,并与其它新城疫病毒进行了同源性比较,证明QNDV／89株核苷酸的变异引起了其蛋白质二级结构的部分改变。     

新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒（NDV）F基因序列设计了一对引物,用RT-PCR方法扩增了8个NDV贵州分离株的F基因片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1662bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.0%～99.7%和87.5%～99.3%,但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的氨基酸同源性为87.2%～97.7%。F蛋白裂解位点的氨基酸序列分别为112R-R-Q-R/K-R-F^117（其中P1、H2、N98、DQ、FW、BY、GZ7株为强毒）和112G-R-Q-G-R-L^117（TN1株为弱毒）。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,4个分离株（P1、H2、、N98、DQ）为基因Ⅶ型,2株（GZ、TN）为基因Ⅱ型,2株（FW、BY）为基因Ⅸ型。     

鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98-1株F基因全序列的克隆和序列分析

本研究报道了PMV－1／鸽／肇庆／1／1998株（ZQ98－1）F基因的全序列。该基因核苷酸序列长度为1712bp,编码由553个氨基酸组成的F0多肽。F0蛋白裂解位点处的氨基酸序列为^112K-R-Q-K-R-F^117,F0蛋白中有3个与病毒副合相关的重要抗原位点和6个糖基化位点。经比较,鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98－1株和PMV－1／Pigeon/England/1168/84(1168/84)株、Warwick株及Ulster株核苷酸序列的同源性分别为95％、90％和89％,氨基酸的为异率分别为5．4％、6．2％及9．1％。     

免疫鸡群新城疫病毒的分离与分子鉴定

从免疫鸡群中分离到9株新城疫病毒（NDV），其中5株为强毒株，4株为中强毒株。用RT—PCR扩增F基因cDNA片段，并将其分别克隆到pGEM—Teasy载体中。序列分析结果表明，上述分离株F基因长度为1662bp，编码553个氨基酸，其F蛋白的氨基酸序列同源性为96．0％～99．8％；但与常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6％～92.2％，F蛋白裂解位点序列为^112R-R-Q／R—K—R—FI—G^119,均属于基因Ⅶ型NDV。     

鹅源I型禽副粘病毒JG97株F基因的分子特性分析

根据GenBank中鸡新城疫病毒（NDV）基因序列合成了1对引物,通过RT-PCR扩增出了鹅源I型禽副粘病毒（AMPV-1）或NDV JG97株的F基因。将扩增片段克隆到pGEM-T载体中,并进行了序列测定。该片段含1个完整的、长1662bp的F基因开放阅读框（ORF）,编码的F蛋白长553个氨基酸,其中含有12个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸顺序为^112R-R-Q-K-R-F^117,与NDV强毒株特征相符。同源性分析表明,JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97株的核苷酸和蛋白氨基酸的同源性分别为94．6％-99．6％和96．6％-99．5％,与LaSota株的核苷酸和氨基酸的同源性仅为84．6％和88,8％。结果表明JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97等5个毒株的遗传关系较近,而与LaSota株差异较大。     

鸭源新城疫病毒SS1株全基因序列测定及遗传进化分析

对从贵州省某三穗鸭养殖场病死鸭体内分离的1株新城疫病毒(NDV)Sheldrakeduck/China/Guizhou/SS1/2014(简称SS1株)进行部分生物学特性测定及全基因测序与分析。结果表明:SS1株的MDT、ICPI和IVPI分别为52 h、1.89和2.80,F基因编码蛋白的裂解位点序列为~(112)R-R-Q-K-R-F~(117),HN基因编码571个氨基酸,均符合NDV强毒株特征;SS1株基因组全长为15 192 bp,各基因片段核苷酸序列与代表性基因Ⅶ型毒株ZJ1、NA-1、SF02和FP1/02相似性最高,达96.3%~98.7%,而与疫苗株V4、La Sota和Mukteswar同源性最低,为82.8%~85.4%;根据F基因序列绘制的系统进化树显示SS1株属于ClassⅡ基因Ⅶd亚型。F和HN蛋白氨基酸序列分析发现,SS1株F蛋白中和抗原位点第170位氨基酸、HN蛋白抗原区及其邻近氨基酸位点与国内当前流行的基因Ⅶd亚型NDV毒株一致,而与疫苗株有较大的差异。此外,交叉血凝抑制试验结果表明,SS1株与传统疫苗株La Sota的抗原同源性为84.5%,而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性为100%,表明分离株与疫苗株存在一定的抗原差异。     

新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。     

半番鸭源禽1型副粘病毒FM01株的分离鉴定与F蛋白基因分析

从表现类似新城疫症状的病死半番鸭中分离到1株病毒FM01株，经血凝及血凝抑制试验证实为禽1型副粘病毒、以SPF鸡胚测定其平均致死时间为113，4h，对1d雏鸡脑内接种致病指数为0．23，表明为温和型毒株。利用RT-PCR技术一次性扩增其F蛋白全基因，克隆到pMD 18-T质粒载体，测序后获得F基因全序列，并推导出其相应的氨基酸序列。FM01株的F蛋白基因完整的编码区全长1662bp，编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，具有温和型毒株特有的氨基酸序列结构．与常见新城疫毒株的核苷酸同源性在88．4％～99.6％之间，氨基酸同源性在89．2％～99.1％之间。     

新城疫病毒分离株F基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR分别扩增出新城疫病毒(NDV)青海株(QH3)、黑龙江株(HLJ)和甘肃株(A4)的融合蛋白(F)基因的全长核苷酸,再克隆到pMD18-T载体中.经酶切和质粒PCR鉴定,获得阳性重组质粒后,进行序列测定并推导出其氨基酸序列,同时进行分析和比较.序列分析结果表明,所获得的3个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1 662 bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;3个毒株之间的核苷酸序列同源性为88.0%～90.6%;与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有85.3%～91.6%.三者F基因的裂解位点均为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征.以1 bp～374 bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,QH3株NDV为基因Ⅷ型,A4株NDV为基因Ⅵ型,HLJ株NDV为基因Ⅸ型.     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.     

鸵鸟源新城疫病毒TN株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术对1株鸵鸟源新城疫病毒TN株融合蛋白基因(F基因)进行扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定,并与国内外NDV毒株对应序列进行比较分析.结果表明,TN株F基因的长度为1 662 bp,可编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,为1株新城疫弱毒株;与贵州省其他禽源(包括肉鸡、蛋鸡、越南斗鸡、七彩山鸡和鸽子等)毒株间的核苷酸同源性为84.0%～89.6%,氨基酸同源性为87.5%～92.1%;与国内外NDV代表株(Lasota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW2000株)的核苷酸同源性为84.4%～98.6%,氨基酸同源性为88.3%～98.0%.经系统发生树分析,TN株与NDV弱毒株Lasota株和B1株在同一分支上,属于基因II型NDV.     

辽宁省新城疫病毒F基因和HN基因的分子特征与致病性

采用RT-PCR对新城疫病毒辽宁分离株的F基因和HN基因进行扩增并测序,初步研究其分子特性分析和致病性。结果表明,分离株CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的致死鸡胚平均时间(MDT)分别为50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h,CY1株具有强毒特征。F基因分型显示,CY1株属于Ⅶ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒氨基酸基序特征,与流行株js02株的亲缘关系非常近,与疫苗株LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。DD2株、YK1株和TL4株均属于基因Ⅱ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112GRQGRL117,符合NDV非强毒氨基酸基序特征,与LaSota株亲缘关系最近。本研究将为本省新城疫防制对策的制定提供参考。     

广东鸽禽Ⅰ型副黏病毒基因Ⅶ型的分离鉴定

2007年在广东某发病鸽群中分离到一株鸽禽Ⅰ型副黏病毒（GM01）．经测定,其鸡胚平均死亡时间（MDT）为76h,鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1．3,在鸡和鸡胚上为中等毒力病毒。应用RT—PCR对F基因片段进行扩增并测序,结果表明该F蛋白裂解位点处氨基酸序列为112R—R—Q—K—R—F 117,是典型的强毒株序列。用DNASTAR软件对GM01株F基因片段与国内外相关的NDV参考株进行比较,结果表明GM01株与Chicken／Gx／14／2005株的核苷酸和氨基酸相似性分别为98．6％和98．4％;与Pigeon-Gxp40毒株核苷酸和氨基酸相似性分别为98．5％和98．7％,在遗传进化树中位于同一个分支,同属于基因Ⅶ型;与国内代表性弱毒疫苗株LaSota毒株和NDV强毒株F48E9的核苷酸及氨基酸相似性分别为84．1％和86．5％及86．3％和88．0％。     

新城疫病毒Lasota株F基因的克隆和序列分析

本试验采用RT-PCR方法对NDV Lasota株的全长F基因进行了扩增与克隆，并对其进行测序。扩出的F基因核苷酸长度为1664bp，单一的开放阅读框编码553个氨基酸的长肽，序列中有6个糖基化位点，13个半胱氨酸残基，包括完整的F1片段和完整的F2片段。裂解位点区(112-117aa)氨基酸序列为Gly-Arg-Gin-Gly-Arg-Leu，与所有弱毒株在这一区域的序列(Gy-Arg／Lys-Gin-Gly／Ser-Arg-Leu)相符。同源性分析表明，Lasota株F基因与已发表的其它NDVF基因相比，核苷酸序列同源性在88％-99％之间，推导的氨基酸序列同源性在90％～99％之间。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。