甜菜NAC转录因子家族BvNAC46基因的RNAi载体构建

NAC转录因子家族成员在调控植物生长发育、参与植物生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。本研究以抗旱甜菜(Beta vulgaris L.)幼苗叶片为材料,提取叶片总RNA并反转录cDNA,通过PCR方法扩增获得甜菜NAC转录因子家族成员BvNAC46基因的RNAi靶片段,利用中间载体pBSK作为媒介,采用传统的"酶切-连接"法构建了含有CaMV 35S启动子、BvNAC46基因片段反向重复序列的RNAi (RNA interference)植物表达载体pCambia2301ky-BvNAC46-RNAi,为进一步鉴定BvNAC46基因在甜菜抗旱中的功能及其作用机制奠定基础。     

甜菜TIFY基因家族的全基因组鉴定与生物信息学分析

TIFY转录因子对植物体生长发育和胁迫响应有重要调控作用,本研究目的在于鉴定分析甜菜(Beta vulgaris L.)中的TIFY转录因子。试验以甜菜基因组数据为基础,利用生物信息学技术在全基因组水平鉴定并分析甜菜TIFY家族成员。结果表明：甜菜中共有21条TIFY基因,基因间序列相似性较低;共线性分析发现只有BvTIFY15与BvTIFY18之间存在基因复制事件;BvTIFY转录因子家族包括2个TIFY蛋白、8个JAZ蛋白、6个ZML蛋白、5个PPD蛋白;蛋白互作预测发现,JAZ家族成员对JA信号有重要的调控作用。本研究对BvTIFY基因的结构与功能进行分析,发掘出甜菜根中应答盐胁迫基因BvTIFY13与BvTIFY15,为后续BvTIFY基因的功能研究提供一定理论基础。     

甜菜抗非生物胁迫研究进展

本研究主要从旱涝、盐碱、高低温以及土壤重金属污染4方面综述了非生物胁迫对甜菜生长发育、生理生化及分子水平的影响。研究发现甜菜在非生物胁迫下净光合速率下降,渗透调节物质浓度改变,活性氧代谢物质含量产生变化,生长发育受到影响;甜菜抗水分胁迫基因包括PSC5、PSCR、2-cysprx、NADK、cprx1、AVP1、Bv-txas等,MYB转录因子和NAC转录因子也在非生物胁迫中起重要作用;甜菜M14品系具有抗旱、耐盐等优良特性。WRKY家族转录因子、BvM14-Tpx、BvM14-CCoAOMT等基因、过氧化酶BvpAPX及各类盐应答蛋白质在抵抗盐胁迫中起促进作用;甜菜抗高低温研究较少,研究表明低温胁迫产生了甜菜抽薹基因的差异表达,甜菜SbSEC14基因在逆境条件下起到信号传导的功能;甜菜抗重金属胁迫研究进展近些年发展迅速,BvGS、BvMTP11、BvHIPP24、BvGST基因陆续被克隆。本研究提出今后应进一步加强甜菜抗非生物胁迫机制及应用的挖掘与创新;充分挖掘野生种中DREB基因,通过转基因技术培育抗逆性强的甜菜品种（系）;在单一逆境研究基础上,进一步开展多逆境条件下的抗逆研究;在生产上应用外源调控物、抗氧化剂、硅等抵御非生物胁迫对甜菜的生长发育影响。     

植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。     

番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料,克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中,转化DH5α,,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明,克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp,用GenBank中的Blastn程序分析表明,其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导,这为克隆番茄WRKY基因全长,进而为番茄抗病育种奠定基础。     

葡萄病毒AMP基因RNA干扰载体的构建

RNA干扰（RNAi）介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。本文以GVA运动蛋白（MP）基因为模板扩增出了418 bp的基因片段,根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向分别插入到载体pFGC5941内含子的两侧以便其转录过程中高效产生RNA发夹结构。经PCR扩增证明已成功构建以GVA MP基因为靶标的干扰载体pFGC5941-GVAFR,并成功转入农杆菌EHA105中,为后续探讨干扰载体的干涉效果奠定了基础。     

喜马拉雅紫茉莉MYB家族的生物信息学及表达分析

旨在筛选高山植物喜马拉雅紫茉莉调控类黄酮等次生代谢产物合成的MYB转录因子(MhMYB)基因家族。基于喜马拉雅紫茉莉愈伤组织低温转录组测序数据库,利用PlantTFDB 3.0和BLASTP等软件对MhMYB序列进行筛选与鉴定,使用Web Logo 3.0、MEGA 7.0和Mev等生物信息学软件对MhMYB转录因子进行结构域、系统进化及低温诱导表达水平分析。研究筛选出34个喜马拉雅紫茉莉MhMYB家族成员,分别为1R-MYB（2个）、R2R3-MYB（30个）和3R-MYB（2个）3类转录因子;亚细胞定位预测大多数定位于细胞核中;进化分析显示,MhMYB家族成员可分为15个亚类,基于拟南芥AtMYB家族成员的生物学功能,预测MhMYB的S2、S7、S20亚家族成员可能参与调控类黄酮等次生代谢产物合成;转录组数据分析显示,低温可诱导MhMYB6、MhMYB15、MhMYB62基因表达水平增加;共表达分析发现,MhMYB6、MhMYB15、MhMYB62对类黄酮合成途径基因起到一定调控作用。初步研究表明,MhMYB6、MhMYB15、MhMYB62可参与调控低温诱导喜马拉雅紫茉莉类黄酮的累积。     

白菜型油菜WRKY基因片段的克隆与表达分析

WRKY转录因子能广泛地参与植物的生物与非生物胁迫反应。为了研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控,首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段, 用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术（real-time relative quantification PCR,以下简称RT-qPCR）检测WRKY基因在ABA(100 μM)诱导不同时段的差异表达。在白菜型油菜中克隆到一段中克隆到一段长度为680 bp的WRKY基因片段和一段长度为933 bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1 h后表达量最高。本实验文成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。     

南瓜CmNAC基因片段的克隆与序列分析

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子,其家族成员N端含有保守氨基酸序列,C端为高度变异的转录激活区。本项研究以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC、辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440 bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,而后对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析,结果表明所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC。该基因片段具有其他植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。     

向日葵WRKY转录因子家族鉴定与生物信息学分析

WRKY转录因子家族参与了多种激素调节信号通路,在帮助植物响应外界不良环境中起着重要作用。本研究基于向日葵(Helianthus annuus)基因组数据库对向日葵进行了WRKY基因家族成员鉴定、进化关系分析、基因定位、基因结构和保守Motif分析、功能启动子元件和基因共线性分析。结果表明:向日葵中包含117个WRKY家族基因,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类,其中Ⅱ类包含Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe五个亚家族。染色体定位显示HaWRKY基因在向日葵所有染色体上均有分布,第10号染色体上分布最多含有18个HaWRKY基因,2号和13号染色体分布最少仅有3个HaWRKY基因。向日葵WRKY转录因子蛋白在59～940个氨基酸之间,平均氨基酸个数为345个,等电点为5.01～10.19不等。基因结构分析表明除Ha WRKY52、HaWRKY82不含内含子,其他成员都含有1～9个不等的内含子。保守域分析表明有12个HaWRKY家族基因WRKYGQK发生了变异,占向日葵WRKY家族的10%。此外,启动子分析表明HaWRKY家族基因启动子区含有大量响应生物胁迫和非生物胁迫元件,共线性分析得到11对加倍复制基因。本研究结果有助于了解向日葵WRKY基因家族成员的情况,为向日葵WRKY基因家族成员进一步的功能分析提供基础。     

能源甜菜BvHIPP24基因的特性及在酵母中的镉耐受功能分析

为了进一步研究重金属相关异戊二烯化植物蛋白在重金属逆境下的解毒机制,本研究克隆了能源甜菜BvHIPP24基因并分析了其在镉逆境下酵母中的功能。本研究以能源甜菜为实验材料,利用RT-PCR的方法克隆获得能源甜菜BvHIPP24基因,并对BvHIPP24基因进行生物信息学分析;利用酵母表达载体构建pYES2-BvHIPP24重组质粒并转化到酵母InVSc1,在真核酵母细胞中进行BvHIPP24基因应答镉胁迫的研究。生物信息学分析显示BvHIPP24基因的CDS全长444 bp,编码147个氨基酸,氨基酸序列的分子量为16377.34 Da,理论等电点为9.39,为亲水蛋白,不含有跨膜区域,定位于叶绿体。保守结构域分析该基因具有一个HMA结构域。构建进化树分析表明,能源甜菜BvHIPP24蛋白与BvHIPP23蛋白质具有较近的亲缘关系。当施加0.5 mmol/L CdCl₂胁迫后,适量表达BvHIPP24的重组菌与对照菌株相比,其生长趋势明显优于后者,并发挥着相对更高的Cd耐受性。这说明,能源甜菜BvHIPP24基因在镉逆境胁迫下发挥着重要的解毒作用,并有可能直接或间接参与细胞重金属离子吸收、转运及代谢平衡等过程。     

水涝胁迫对不同土壤盐碱度下甜菜幼苗生长及光合特性的影响

为探究水涝胁迫对不同土壤盐碱度下甜菜幼苗生长的影响,验证甜菜在水涝逆境中的生长规律,评估水涝胁迫对盐碱地甜菜种植的影响,以甜菜‘SV1433’为供试品种,以微酸性黑土为基础利用NaCl、Na₂SO₄、Na₂CO₃、NaOH调节土壤盐碱度,采用室内土培法,设置微酸土、盐渍土、盐碱土3个土壤盐碱梯度下对照及水涝胁迫共6组处理。结果发现,播种9天后出苗结束,微酸土中甜菜出苗较快,优于盐渍土及盐碱土;播种26天后收苗,在微酸土、盐渍土、盐碱土3种土壤盐碱度下,水涝胁迫比对照植株鲜重分别降低40.7%、26.9%、25.2%,干重分别降低41.1%、29.9%、24.8%,株高分别下降20.4%、19.1%、16.3%,表明随土壤盐碱度升高水涝胁迫对甜菜幼苗鲜重、干重、株高影响逐渐降低;水涝胁迫下幼苗根面积及叶面积显著降低,植株叶长显著下降,叶片净光合速率、蒸腾速率、叶片气孔导度显著降低,表现出水涝胁迫下盐碱土中甜菜幼苗生长较好,优于盐渍土及微酸土。     

转录因子BvM14-Dof3.4响应盐胁迫的功能研究

Dof(DNA binding with one finger)家族转录因子是植物特异的转录因子,在胁迫响应、种子发芽、氮同化、光合作用等多种生物学过程中发挥着重要作用。为了探究转录因子BvM14-Dof3.4在响应盐胁迫过程中的生物学功能,本研究以具有强耐盐特性的甜菜M14品系为试验材料,用花序浸染法将BvM14-Dof3.4基因在野生型拟南芥植株中异源表达,经150 mmol/L NaCl处理后发现,BvM14-Dof3.4基因的异源表达促进了盐胁迫下转基因拟南芥植株根的生长,提高了异源表达植株的鲜重和干重,与野生型拟南芥相比异源表达植株中K⁺/Na⁺比值增加1.3倍、甜菜碱含量增加1.1倍以及SOD和POD的酶活性分别上调1.3和1.2倍,从而减少了盐胁迫对异源表达拟南芥植株的损伤。这些结果表明了BvM14-Dof3.4基因响应盐胁迫,并且BvM14-Dof3.4基因的异源表达能够提高拟南芥植株的耐盐能力,该结果对甜菜M14品系优质基因资源的挖掘以及开展栽培甜菜抗逆性的遗传改良工作具有重要意义。     

转录因子BvM14-GAI耐盐功能研究

转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜 M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K⁺/Na⁺差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。     

甜菜BvGSTU9基因的生物信息学及在镉胁迫下的表达分析

为了进一步研究甜菜谷胱甘肽转移酶BvGSTU9 (LOC104894060)在重金属胁迫过程中的功能。本研究以‘780016B/12优’为实验材料,对该基因序列特征、结构、功能进行预测分析,并利用qPCR检测该基因在不同浓度镉胁迫下的表达量变化。结果显示甜菜BvGSTU9基因全长925 bp,开放阅读框675 bp,编码了由224个氨基酸组成的不稳定膜外蛋白。BvGSTU9与菠菜、藜麦的氨基酸序列相似性较高,与系统发育进化树分析结果基本相符。二级和三级结构预测表明该基因主要由α-螺旋、β-折叠、延伸链及无规则卷曲组成。qPCR显示BvGSTU9基因在不同浓度的镉胁迫下均受到不同程度的诱导,因此可以推断甜菜BvGSTU9基因无论从结构还是功能上,与镉逆境胁迫存在着一定的应答关系。研究结果也为甜菜耐重金属镉机制研究提供参考依据。     

甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究

为了研究甜菜M14品系BvM14-Tpx基因的抗氧化功能,本试验以带有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系M14品系为试验材料,利用RACE技术获得甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx) cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用Real-time PCR和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,在原核表达体系下进行BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫研究。生物信息学分析结果表明,BvM14-Tpx基因cDNA全长为1044 bp,包含最大的ORF为489 bp,编码162个氨基酸;含有过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)型的保守结构域;BvM14-Tpx蛋白与豌豆(Pisum sativum L.)和苜蓿(Medicago truncatula L.)中Tpx蛋白的亲缘性较高。组织特异性表达分析结果表明,BvM14-Tpx基因在甜菜M14品系各组织表达量从高到低的顺序是根、茎、叶、花。通过原核表达体系下BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫的研究,表明BvM14-Tpx基因能够提高大肠杆菌对于环境中氧化胁迫的适应能力,减轻H₂O₂对细菌生长的抑制。本研究对挖掘甜菜M14品系优质基因,提高甜菜对于非生物胁迫的抗性以及开展甜菜遗传改良工作具有重要意义。     

氮胁迫对甜菜幼苗生理以及相关NRTs基因表达的影响

为了深入研究缺氮环境下甜菜(Beta vulgaris L.)的氮利用调控机制,并为利用分子育种以及基因工程途径提高植物的氮利用率奠定基础,本研究以甜菜幼苗‘780016B/12优’为试材,通过对其施加低氮和缺氮逆境胁迫,利用表型观察、叶绿素含量的测定以及相关基因和酶活性的应答变化分析,来研究甜菜植株在生理以及分子方面的应答机制。研究结果表明,甜菜叶片由于缺氮而表现出局部变黄,并且SPAD值显示,叶绿素含量随逆境时间呈下降趋势。qPCR表明,BvNRT2.1和BvNRT3.2基因均受到低氮和缺氮胁迫的诱导,且它们在根部的表达量要高于叶中,BvNRT2.1基因对逆境的应答更为显著。同时,随着胁迫时间的增长,甜菜体内的硝酸还原酶活性逐渐下降,但叶片中该酶的活性始终要高于根中。因此可以得出结论,低氮或缺氮逆境对甜菜幼苗的光合作用、硝酸还原酶活性造成了较为严重的影响,从而导致其生长在一定程度上受到抑制。可以推断,为了适应氮胁迫环境,甜菜自身可能通过上调硝酸盐转运蛋白基因的表达等途径来直接或间接的补偿由于环境氮缺乏或低氮造成的营养缺失,以抵御逆境伤害。     

甜菜热激蛋白基因BvHSP18.2的克隆和生物信息学分析

旨在通过基因克隆及生物信息学分析,预测甜菜小分子热激蛋白BvHSP18.2 (LOC104903994)的功能。以甜菜‘780016B/12优’为试验材料克隆BvHSP18.2,获得BvHSP18.2基因全长;通过ProtParam tool、SWISS-MODEL、MEGA11等对BvHSP18.2的理化性质、蛋白结构、多序列比对等信息进行分析。RT-PCR扩增得到的BvHSP18.2基因全长为962 bp,编码158个氨基酸,分子式为C₉₂₈H₁₄₆₆N₂₆₆O₂₈₄S₆,属亲水性不稳定的小分子热激蛋白家族;该基因编码蛋白含13个磷酸化位点,α螺旋和无规则卷曲等主要构件。进化关系发现BvHSP18.2与藜麦、菠菜的sHSP同源性相似。同时,BvHSP18.2基因启动子区域具有参与防御和应激反应等顺式作用元件,推测其在甜菜生长发育和胁迫应答中发挥重要作用。本结果为进一步开展该基因的功能和遗传调控机制研究奠定了基础。     

硼素对甜菜内源激素的影响研究

优化利用高效液相色谱法测定甜菜叶片中IAA、GA₃、ZT、ABA 4种内源激素的条件,研究不同硼浓度下4种内源激素含量及比例的变化,为甜菜生产实践提供理论支持。以甜菜单粒种HI0099为试验材料,在室内水培条件下,设置十分缺乏、缺乏、适量及过量硼营养浓度,利用高效液相色谱法,对甜菜叶片中IAA、GA₃、ZT、ABA进行测定,分析各激素含量变化与硼处理浓度之间的关系。结果表明,随着硼浓度的增加,甜菜叶片内IAA、GA₃、ZT的含量呈先升高后降低的趋势,ABA含量随着硼浓度的增加表现为先降低然后升高的趋势。缺硼和硼毒害胁迫都会使甜菜叶片中IAA、GA₃、ZT含量降低,同时使ABA含量升高,IAA/ABA、GA₃/ABA、ZT/ABA比值降低。缺乏胁迫情况下,硼素营养水平与甜菜叶片ZT/ABA比值之间呈现显著正相关(r=0.866^*);硼素毒害胁迫情况下,硼素营养与植株叶片ABA含量呈显著正相关(r=0.958^*),与ZT/ABA比值呈显著负相关(r=-0.915^*)。综合分析说明,硼素改变了甜菜叶片激素的含量及平衡关系,可以通过大田试验验证和利用外源植物生长调节剂来调控植物内源激素平衡最终缓解甜菜硼胁迫影响。