小鹅瘟病原学与检测方法的研究

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野生强毒.采用鹅胚增殖病毒,以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原;以感染鹅胚尿囊液人工接种5日龄健康雏鹅,复制出与自然感染病例相类似的病变; 通过电镜观察到典型的小鹅瘟病毒粒子.该分离毒株核酸分子量为5 000 bp.制备的小鹅瘟沉淀抗原可以检测患病雏鹅血清中的抗体,监测治疗血清的滴度和疫苗接种的效果.标记的小鹅瘟荧光抗体能直接检测患病雏鹅组织中的病毒抗原.针对编码主要结构蛋白VP3的基因设计合成一对引物,扩增出与预期长度相符的特异性DNA片段.     

霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒VP3基因的克隆及序列分析

采用聚合酶链式反应(PCR)方法对国内霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒分离株(GPV-H)的结构蛋白VP3基因进行扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序.结果表明,GPV-H株VP3的核苷酸序列全长1 605 bp,编码534个氨基酸,与GenBank发表的13株小鹅瘟病毒VP3相比,核苷酸同源性在92.5％～98.9％之间.通过基因进化树分析可以看出,GPV-H株与波兰和匈牙利分离到的5株病毒亲缘关系较近.     

1株小鹅瘟病毒的分离与鉴定

自山东省某鹅场病死鹅组织病料中分离到1株小鹅瘟病毒,命名为SD株。对其进行了PCR检测、电镜观察、回归动物试验和特异性鉴定。结果表明,该分离株的VP3基因扩增片段为436 bp,与小鹅瘟病毒基因序列同源性达到95%以上;病毒形态与小鹅瘟病毒基本一致;鹅胚尿囊液毒肌肉接种4日龄雏鹅10日内80%死亡,死亡雏鹅剖检主要病变为肿大,表面有坏死斑,十二指肠肠腔膨大,肠道黏膜脱落。该分离株的确定为小鹅瘟的精准防控提供了依据。     

番鸭三种细小病毒野毒株试验感染雏鸭的临床症状及解剖病理变化差异研究

番鸭"三周病"、细小病毒型"白点病"和小鹅瘟是雏番鸭常见的三种细小病毒病,对番鸭养殖业危害较为严重。本文对从广东惠州及周边地区病死番鸭中分离鉴定的1株番鸭细小病毒型"白点病"病毒、1株小鹅瘟病毒和1株番鸭"三周病"病毒分别感染健康雏番鸭,将发病的临床症状、病理学变化进行对比,从而为基层兽医工作者提供三种番鸭细小病毒病临床鉴别、初步诊断更加直观的依据。     

小鹅瘟套式PCR诊断方法的建立及初步应用

本试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计了两对VP3基因的特异性引物,进行PCR扩增,建立了小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法,该方法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带。本方法对病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为0.02175 fg/μL。通过对延边地区疑似小鹅瘟的80只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为95%。结果表明,本试验建立的小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法具有极高的敏感性和特异性且检出率极高,可作为一种有效的临床诊断方法。     

小鹅瘟病毒PCR诊断方法的建立及初步应用

为了建立小鹅瘟病毒PCR诊断方法,试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列设计1对VP3基因的特异性引物进行PCR扩增。结果表明:该法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段,而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带;病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为2.175 fg/μL;用该法对延边地区疑似小鹅瘟的44只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为91%。     

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。     

小鹅瘟病毒山东株的分离鉴定及VP3基因序列分析

从山东某患病鹅群中分离到一株病毒。根据小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因全序列,设计了一对特异性引物,提取病毒DNA进行PCR反应,成功扩增出372 bp的特异条带。将PCR产物纯化后,与pMD18-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后,对阳性克隆进行测序。测序结果表明该小鹅瘟病毒毒株的VP3基因片段与GenBank已公布的GPV相应序列的同源性在94.1%~98.4%之间。     

番鸭细小病毒型“白点病”PCR检测方法的建立与初步应用

番鸭细小病毒型"白点病"主要侵害三周龄以内的雏番鸭。番鸭细小病毒型"白点病"通常与番鸭小鹅瘟以及番鸭"三周病"混合感染,且番鸭小鹅瘟与番鸭"三周病"临床症状和病理变化相似,因此给临床诊断带来了困难,甚至造成误诊。针对这种情况,本文在细小病毒的保守区域设计了一对细小病毒通用引物P1、P2;在番鸭"三周病"病毒的特异性区域设计了一对特异性引物M1、M2;在番鸭小鹅瘟病毒的特异性区域设计了一对特异性引物G1、G2。利用所设计的三对引物进行PCR检测,能够快速、准确地诊断出雏番鸭细小病毒型"白点病",以及与番鸭小鹅瘟或者番鸭"三周病"的混合感染。     

基于VP1基因的小鹅瘟病毒PCR快速检测方法的建立和应用

根据Gen Bank公布的小鹅瘟病毒VP1基因保守序列设计了一对引物,建立了检测小鹅瘟病毒PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对小鹅瘟病毒扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对小鹅瘟病毒检测的灵敏性为1pg总DNA量。以上结果表明,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于小鹅瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中番鸭"三周病"病毒(MDPV)、小鹅瘟病毒(GPV)的NS基因和VP基因,以及华南农业大学禽病组分离到的细小病毒型"白点病"病毒(MDWNV)的NS和VP基因序列,设计3对特异性引物,并在建立单项PCR技术的基础上,优化多联PCR反应条件(EX-Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度以及退火温度等),建立了MDPV、MDWNV和GPV三种病毒的多联PCR检测方法。本研究结果表明,该番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法具有特异、快速、准确、敏感的特点,能同时鉴别诊断这三种番鸭细小病毒,并可直接应用于临床典型病变组织的检测。     

小鹅瘟病毒的分离鉴定与临床病变观察

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野毒。采用鹅胚扩增病毒。以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原,用感染鹅胚尿囊液人工接种8日龄健康雏鹅,雏鹅表现出典型的小鹅瘟临床症状和剖检特征。     

小鹅瘟病毒常州株的鉴定及其致弱研究

从具有小鹅瘟典型症状、病变的病死雏鹅病料中分离到疑似小鹅瘟病毒常州株GPV／JSCZ／2004／01。通过磷钨酸负染经透射电镜观察可见细小病毒样病毒粒子，取死亡胚尿囊液浓缩后与GPV阳性多抗血清作用显示有阳性琼扩线出现，通过GPV特异性引物和相应的PCR试验，扩增出了特异性的DNA条带。研究结果表明分离到小鹅瘟病毒常州株。对常州株第3代毒进行番鸭胚半数致死量（ELD50）测定，为10^-3．1／0．2mL。将分离毒GPV／JSCZ／2004／01感染鹅胚成纤维细胞（GEF）并连续传代培养，结果显示该毒株在细胞培养传代到第9代时能用单抗介导的间接免疫荧光试验检测到病毒在GEF的感染，表明产生了细胞适应毒（CZ—ca）。取第14代细胞毒（CZ—ca14）10倍比稀释测定TCID50，同时进行雏鹅致病性试验，结果显示细胞毒的TCID50为10^-9.4／0．2mL，对雏鹅的发病率和死亡率为0，但原始分离株的发病率和死亡率为100％。研究结果进一步证明小鹅瘟强毒株通过连续细胞传代培养可以达到致弱效果，为小鹅瘟病毒致弱研究提供了参考。     

2012—2018年福建省部分地区番鸭临床病例细小病毒病病原检测

为初步了解福建省番鸭细小病毒病流行情况,提出相应的防控方法,2012—2018年,在福州、莆田、漳州和三明4个主要番鸭饲养区18个固定养殖场,收集435例临床病例样品,进行番鸭细小病毒病(番鸭三周病和番鸭小鹅瘟)病原检测,分析病原感染状况。结果显示:2012—2018年,在435例临床病例中,检出番鸭细小病毒病病原阳性病例155例,阳性检出率为35.6%(155/435),其中番鸭三周病阳性病例102例,番鸭小鹅瘟阳性病例125例,两种病混合感染病例72例。2012—2014年,番鸭三周病病原检出率约为40.0%,2015年降至27.4%,2016—2018年降至5.0%以下,病原检出率大幅下降(P<0.01);2012—2018年番鸭小鹅瘟病原检出率在23.4%~34.9%之间,检出率下降不明显(P>0.05)。分析认为,2014年番鸭三周病商品疫苗的推广应用大大降低了三周病的临床发病率,使该病已非导致番鸭临床发病的主要因素;而对于番鸭小鹅瘟,因缺乏针对性的有效疫苗,防控效果不明显。因此,该地应继续加强番鸭三周病活疫苗的免疫,最终净化该病;而对于番鸭小鹅瘟,需做好综合防控,可免疫鹅细小病毒弱毒疫苗,控制临床发病,减少疫病造成的损失。     

小鹅瘟病毒贵州株的分离与鉴定

采用鹅胚接种、动物感染、电镜观察及病原核酸与结构蛋白分析等方法对贵州省某养殖场疑似小鹅瘟病例进行了病原的分离与鉴定.结果:该病例组织病料可使鹅胚呈现特征性病变,雏鹅人工感染后能表现出与自然感染病例相似的症状;电镜下病毒粒子直径为20～25 nm,无囊膜,具有典型细小病毒特征;经1%琼脂糖凝胶电泳,病毒核酸扩增片段约为5100 bp;经SDS-PAGE发现,病毒结构蛋白由3条多肽组成,即VP1、VP2、VP3,分子量依次为88、68、57 ku.实验成功分离得到了一株贵州小鹅瘟病毒流行毒株.     

雏番鸭细小病毒病快速诊断方法的建立

番鸭三周病、番鸭细小病毒型“白点病”以及番鸭小鹅瘟在临床上发病日龄非常相似,也是各个养鸭场经常出现的疾病,它们有时会出现混合感染或继发感染,给诊断带来了困难。针对这种情况,本文通过对三周病病原、番鸭细小病毒型“白点病”病原以及番鸭小鹅瘟病原核酸的分析比较,在三周病病原的特异性区域设计了一对特异性引物,通过PCR检测,能够快速、准确的诊断出雏番鸭细小病毒病。     

6株鹅细小病毒的分离鉴定及VP3基因序列分析

为了解吉林省不同地区小鹅瘟流行情况,从吉林省磐石、白城、九台、德惠、辽源、镇赉地区鹅养殖场采集疑似小鹅瘟病料,接种SPF鹅胚后分离到6株病毒(暂命名为PSH、BCH、JLJT、DH、LY、ZL株),经PCR鉴定为鹅细小病毒。VP3基因序列分析结果显示,分离到的6株病毒VP3基因、蛋白与近年来国内流行的鹅细小病毒同源性较高,分别为93.1%～99.6%与95.9%～99.4%。其中,BCH株、JLJT株、LY株属同一分支,与浙江、扬州等地区分离的鹅细小病毒相似性较高,达到99.4%-99.6%;ZL株、DH株、PSH株属同一分支,相似性较低。试验表明,吉林省流行的鹅细小病毒与我国南方地区流行毒株同源性较高,与其他地区流行毒株存在一定差异。     

GPV野毒株鉴定及其致病力试验

在送检的小鹅瘟病料中分离到1株病毒,经NS1基因特异性引物扩增后确定是GPV。用该对引物对从鹅细小病毒野毒感染的病鹅分离的GPV野毒株进行PCR检测,结果该结引物能特异性地扩增出与预期片段大小相符的1.9kb片段。回归试验结果表明,该GPV野毒株的感染潜伏期为8天,病程为1-3天,致死率达100%;对雏鹅半数致死量LD50为3.4。     

5株鹅细小病毒分离鉴定及VP3基因遗传进化分析

从江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织中分离到5株病毒分离物。经过实验鉴定,该5株病毒分离能与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,并均能使用针对小鹅瘟病毒VP3基因特异性引物扩增出与目的条带大小一致的DNA片段。将PCR产物纯化、连接、转化、TA克隆等一系列实验后将获得阳性重组质粒送测序。另外,为了探究该病毒的遗传进化方向,本研究同时对鹅细小病毒VP3基因进行了系统进化分析。     

5株鹅细小病毒分离鉴定及VP3基因遗传进化分析

从江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织中分离到5株病毒分离物。经过实验室鉴定,该5株病毒分离能与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,并均能使用针对小鹅瘟病毒VP3基因特异性引物扩增出与目的条带大小一致的DNA片段。将PCR产物纯化、连接、转化、TA克隆等一系列实验后将获得阳性重组质粒送测序。另外,为了探究该病毒的遗传进化方向,本研究同时对鹅细小病毒VP3基因进行了系统进化分析。