小麦谷氨酰胺合成酶基因可变剪接分析

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是植物氮素同化的关键酶,小麦(Triticum aestivum L.) GS由12个核基因编码,即TaGS1;1-6A/6B/6D、TaGS1;2-4A/4B/4D、TaGS1;3-4A/4B/4D和TaGS2-2A/2B/2D。利用单分子测序技术获得了TaGS基因的全长转录本,发现TaGS1;1-6A有1种可变剪接转录本、TaGS1;1-6B有2种可变剪接形式;与正常转录本编码的TaGS相比,TaGS1;1-6A-1的Gln_synt_N结构域部分缺失,TaGS1;1-6B-3缺少Gln_synth_gly_rich_site结构域;TaGS1;1-6B-4是新鉴定的转录本,编码缺少Gln_synth_gly_rich_site和Gln_synth_cat_do...     

刺五加鲨烯合酶基因DNA和启动子的克隆及分析

在已克隆出的刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)基因cDNA序列基础上,利用TAIL-PCR技术克隆SS的基因组DNA及启动子序列。克隆得到刺五加SS的DNA序列长8 244 bp,启动子序列长1 984 bp,转录起始位点位于起始密码子ATG上游568 bp处。基因包括13个外显子,12个内含子,其剪切符合GT-AG原则。启动子序列含有37个顺式作用元件,其中包括128个TATA-box、38个CAAT-box等核心调控元件,并且含有部分光响应元件、激素应答的元件等顺式调控元件。本研究首次克隆出刺五加SS基因组DNA及启动子序列,为后续研究SS基因表达的调控机制有很大帮助。     

桃PG基因启动子克隆及序列分析

为获得桃多聚半乳糖醛酸酶( PG)基因启动子并分析调控元件,以桃品种大久保基因组DNA为模板,采用染色体步移技术克隆了PG基因的部分序列及其5′侧翼区,并分析其调控元件组成。结果表明,克隆产物长986 bp,3′侧翼序列与 GenBank中的PG基因序列的5′端部分序列同源性为96%,登录号为FJ940722。在789~839 bp位置存在基础启动子序列,转录起始位点位于828 bp的碱基C,其可能性为0.98。除含有CAAT-Box、TATA-Box等基本启动子元件外,还存在众多参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、水杨酸响应元件等应答激素和胁迫信号元件,表明PG基因的转录和表达可能受到激素、干旱、光照等外界环境的胁迫以及衰老的调控。     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

甘蔗ScHAK11基因启动子的克隆与初步分析

钾转运体ScHAK11基因是甘蔗钾转运体基因家族的重要成员。本研究以甘蔗为材料,通过染色体步移方法对ScHAK11上游启动子片段(pScHAK11)进行克隆,获得ScHAK11起始密码子ATG上游启动子序列,序列长度为2 018 bp。序列分析表明,该序列包含多个真核生物启动子核心元件TATA-box、CAAT-box以及与逆境胁迫、光响应、激素诱导、分生组织和叶肉栅栏组织表达等顺式作用元件,推测pScHAK11启动子受到多种激素和逆境胁迫诱导表达,并通过分生组织和叶肉栅栏组织等顺式调控元件参与对甘蔗组织发育的调控。将p ScHAK11启动子序列与包含GUS基因的载体pBI121连接进行活性分析,发现pScHAK11启动子片段能驱动GUS基因在烟草茎和根中瞬时表达。荧光定量PCR结果表明,ScHAK11主要在甘蔗叶片和根系表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pScHAK11启动子驱动的GUS基因在烟草中的表达结果不一致,结果表明p Sc HAK11启动子是组织特异型启动子。本研究结果有助于深入了解ScHAK11基因表达调控的分子机制,为研究ScHAK11基因的转录调控机制奠定基础。     

花生质体型酰基载体蛋白基因5′侧翼调控序列的克隆与分析

采用染色体步移技术分别克隆3个花生质体型酰基载体蛋白(ACP)基因的5′侧翼调控区序列,AhACP1、AhACP4和AhACP5基因5′上游序列分别为535、1400和1180 bp;利用5′RACE方法确定了这3个基因的转录起始位点,分别位于起始密码ATG上游–71、–92和–71 bp处。利用生物信息学软件分析了花生ACPs启动子区包含的主要调控元件,发现尽管花生AhACP4和AhACP5基因在根、茎、叶、花和不同发育期种子中的基本表达模式相似,但它们的启动子中包含各自特有的顺式元件,AhACP4启动子区包含根或芽顶端分生组织表达调控元件WUS,而AhACP5启动子区则含有侧芽萌动和伸展所需的多个关键调控元件E2FB、TELO BOX和UP1,推测它们的表达具有组织和发育阶段特异性。在进化上,花生AhACP4与拟南芥AtACP4可能为直系同源基因,但它们的表达模式产生了分歧,AhACP4为组成型表达,AtACP4主要在叶中表达;与AtACP4启动子相比,花生AhACP4启动子区中参与光调控相关元件明显减少。     

茶树CCoAOMT基因克隆及启动子的结构分析

茶树咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是甲基化EGCG生物合成的一种重要酶,为探明CCoAOMT基因的表达调控规律,进一步解析甲基化EGCG生物合成的调控机制。本研究采用同源克隆法获得了茶树CCoAOMT的cDNA全长序列,采用染色体步移技术(Genome walking)获得了该基因的启动子序列,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,CCo AOMT全长cDNA为1 000 bp,其中开放阅读框长735 bp,编码245个氨基酸,含有caffeoyl-CoA O-methyltransferase和SAM功能结构域;进一步分离得到CCoAOMT基因上游调控序列1 624 bp,发现其含启动子核心元件TATA-box、CAAT-box及5'UTR Py-rich stretch (高水平转录顺式作用元件)、MYB (干旱诱导时的MYB结合位点)、G-box、GAG-motif、GATA-motif、GT1-motif、Sp1 (光响应元件)、CGTCA-motif、TGACG-motif (茉莉酸甲酯响应元件)等重要顺式作用元件。由结果推测,CCoAOMT基因在转录水平受各类转录因子的调控,该结论为进一步研究CCoAOMT基因的转录调控机制提供了理论指导。     

樱桃番茄Cf9基因调控元件预测及同源基因系统发育分析

为探明Cf9基因的表达调控元件和同源基因进化关系,从樱桃番茄品种京番红星中克隆了Cf9上游序列,利用PlantCARE启动子预测工具对转录起始位点上游1500 bp序列进行顺式调控元件分析。结果表明,Cf9启动子不仅含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,而且含有光响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件等。Cf9基因可能受光、水杨酸和茉莉酸甲酯等诱导表达。Cf9同源基因系统进化分析结果表明,当同源指数为0.65时,番茄、马铃薯、辣椒、烟草中含有Cf9同源基因,同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因,分析结果也进一步说明番茄与马铃薯的亲缘关系最近,其次为辣椒、烟草。     

大豆中3个Dof转录因子的生物信息学及表达分析

植物Dof转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探明Dof转录因子参与大豆对非生物胁迫的响应,对大豆中3个Dof转录因子(GmDof2.1、GmDof3.1和GmDof4.6)的基因序列进行生物信息学分析。3个Dof基因分别位于不同染色体上,它们所编码的蛋白序列长度为212～305个氨基酸残基,均具有1个保守的Dof结构域。3个Dof蛋白主要定位于细胞核中且含有不同数量的磷酸化位点。启动子序列分析表明,GmDof2.1启动子序列中含有3种与逆境和激素响应相关的元件(ARE、DRE1和MBS),GmDof3.1启动子序列中含有6种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、TGACG-motif、W-box和WUN-motif),GmDof4.6启动子序列中含有7种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif、MBS、TGACG-motif和WUN-motif)。实时荧光定量PCR结果显示,3个Dof基因均可不同程度的响应高盐、干旱、低温和高温胁迫。GmDof2.1和GmDof3.1在大豆根中的表达量最高,GmDof4.6在大豆茎中的表达量最高。由此推测3个Dof转录因子可能在大豆应对非生物胁迫过程中发挥转录调控作用。     

蛋白和核酸合抑制剂对氮素诱导甜菜谷氨酰胺合成酶基因表达的影响

谷氨酰胺合成酶(GS)家族是甜菜等高等植物体内氨态氮同化酶, 也是氮利用与循环的核心构件。为了揭示在氮素诱导下, 放线菌素D(AMD)和放线菌酮(CHM)对甜菜GS基因调控表达的影响。采用半定量RT-PCR技术, 对甜菜的胞液型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)和质体型谷氨酰胺合成酶基因(GS2)进行mRNA的表达检测, 同时进行GS活性的测定。结果表明, 甜菜幼苗经过低浓度AMD处理2~6 h, GS活性略有增加, 9 h后, 高和低浓度AMD处理下的GS活性都下降, 且随着浓度的增加下降幅度加大, 同时GS1mRNA和GS2mRNA的相对量随浓度的增加而下降。CHM处理甜菜幼苗9 h后, 随着浓度的增加和处理时间的延长, GS活性下降幅度增加, 但GS1mRNA和GS2mRNA的相对量在不同CHM浓度处理间变化不显著。     

基于SNP分子标记的泰山/泰科麦系列小麦遗传解析

对不同年份育成的21个小麦品种（系）进行全基因组扫描,通过分析遗传距离和染色体区段/位点,明确其亲缘关系远近和遗传差异。分析可知,获得的2029个SNP基因位点在B基因组拥有较高的遗传多样性,其次是A和D基因组;在7个同源群中,第3和第6同源群呈现出较高的遗传多样性,而第1和第4同源群的遗传多样性较低;21条染色体中,3A、1B、6B染色体的遗传多样性较高,而1A、6A的遗传多样性偏低。对21份供试材料依据审定（育成）年份分析其群体的平均遗传距离,不同年份品种间的平均遗传距离先增大后减小,遗传多样性逐渐降低;21份供试材料间的遗传相似系数在0.69~0.99之间,大致可聚为4个类群,同一年份的品种一般聚在一起,与其系谱关系吻合。构建并分析供试材料的基因型图谱发现,00s、10s和现在育成的小麦品种（系）共有SNP和共有染色体区段分别主要在A、D和B基因组,对应已发表性状同不同年份育种目标吻合。同时发现21份供试材料均含有25个共同SNP位点,分布在1A、5A、6A、7A、2B、3B、6B、1D、2D、3D和7D染色体上,且每条染色体上分布的SNP位点数目均不相同,通过对应已发表性状进一步证实在品种（系）组配与选育过程中注重产量、株高、分蘖数、抽穗期、灌浆速率和抗病等性状的选择。以上研究结果可为今后小麦新品种组配和选育提供参考依据。     

土壤水分对豫麦34花后GS同工酶及籽粒产量与蛋白质含量的影响

采用盆栽方法,连续两年研究了豫麦34在田间最大持水量40%(40%FC)、60%(60%FC)和80%(80%FC)条件下花后旗叶与籽粒中谷氨酰胺合成酶(GS)及其同工酶活性和可溶性蛋白含量及籽粒产量等的变化特征。结果表明,旗叶中GS活性较同期籽粒中GS活性高10倍以上,并均在波动中下降;旗叶中有GS1、GSx和GS2三种同工酶,其中GS2活性最高,GSx活性最低;籽粒仅有GS1。小麦花后旗叶和籽粒中GS和GS同工酶活性表现为60%FC>80%FC>40%FC,尤以旗叶GS2活性受影响最大。籽粒灌浆高峰前期,旗叶中可溶性蛋白含量表现为60%FC>80%FC>40%FC,随后表现为80%FC>60%FC>40%FC。籽粒中可溶性蛋白含量均表现为80%FC>60%FC>40%FC;60%FC处理的旗叶GS和GS2活性与可溶性蛋白含量呈显著正相关。籽粒产量和蛋白质含量均以60%FC处理最高,说明豫麦34生长中后期适宜的水分管理指标为田间最大持水量60%。     

含6X小黑麦血缘的抗病小麦新材料的种子储藏蛋白分析

６Ｘ小黑麦品种Ｖｅｎｕｓ和２个普通小麦品种杂交回交,选育出ＮＲ９８４９等８个系群９４个系,其中大部份抗条锈病或（和）白粉病。应用酸性聚丙烯酰胺凝胶电脉（ＡＰＡＧＥ）分析了ＮＲ９８４９等系群的６４个株及其亲本Ｖｅｎｕｓ、小偃６号和川育１２号的醇溶蛋白,结果表明,５０．００％的株系具有１ＲＳ／１ＢＬ所特有的Ｇ１ｄ１Ｂ３位点,２０．３１％的株系在Ｇｌｉ－２位点发生了普通小麦与６Ｘ小黑麦遗传物质重组;６４个株系中出现了１种亲本类型,３种重组类型和３种突变重组类型,突变率１５．６２％。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）指出,大多数株系Ｇｌｕ－１位点与普通小麦亲本相同,即由Ｇｌｕ－Ａ１编码的亚基１,Ｇｌｕ－Ｂ１编码的亚基７＋８、１４＋１５,Ｇｌｕ－Ｄ１编码的亚基５＋１０、２＋１２。文中还讨论了６Ｘ小黑麦向普通小     

分离植物目的基因全长cDNA和启动子的新方法--快速定位转录起始位点(RITIS)

启动子是调控外源基因在植物体内表达的“开关”。随着植物转基因技术的广泛应用,无论是基础研究还是应用研究,人们希望能够充分利用启动子来准确控制外源基因在植物体内的表达,使目的基因的“开”和“关”、表达的“多”和“少”、在“何地”和“何时”表达等,能够听从人的指挥,以实现植物育种的分子设计。因此,快速分离和鉴定植物体内各种特异启动子已经成为植物基因工程研究的热点和难点。本文在互补末端连接反向PCR(CELI-PCR)技术基础上建立起一种快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列的新方法。该方法利用CELI-PCR进行染色体连续步移,获取足够长的目的基因及其上游基因组DNA序列,再根据转录起始位点是目的基因转录本和启动子的分界点,其下游转录本中的外显子可通过RT-PCR扩增,而上游启动子序列则不能被RT-PCR扩增这一特点,借助RT-PCR进行cDNA连续步移,直到获得全长cDNA,确定启动子基因5'非翻译区的位置,进而精确定位转录起始位点。从而获取目的基因准确的启动子序列和全长cDNA序列。因此,建立在CELI-PCR基础上的RITIS技术,可绕过繁琐的构建cDNA库和5'-RACE等方法快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列。     

应用SSR分子标记分析小麦品种(系)的遗传重组

为了解小麦品种形成中亲本基因组的遗传重组和遗传保留区段的分布特点,对周麦18和百农AK58及其衍生品系共23个材料进行了全基因组SSR扫描分析。遗传重组分析表明,单交组合的平均重组数(12.3)低于回交组合(13.9);染色体4A、5A、7A、1B、3B、4B、7B、1D、2D、3D、5D、6D和7D重组发生较多,其余染色体重组相对较少,染色体的中间区段与远端区段重组数相当,分别为6.1和6.0。子代间基因组比较发现,一些染色体区段成为重组的多发区,如5D的gwm358–wmc357、6D的cfd49–barc196、7A的wmc158–barc23和7B的gwm274–gwm146区段,分别有35、19、15和14次重组。分析亲本传递给子代的染色体区段,发现子代继承亲本的遗传区段在14~29个,每个区段涉及2~8个多态性位点,大的遗传区段主要分布于4A、5A、5B、5D和7D染色体。以上基因组区域的关联性状是进一步研究的重点。     

大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达GmGS1β2基因功能的初步分析

从Phytozome数据库中获得包括大豆在内的12种植物的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)氨基酸序列,利用MEGA5.10软件进行多序列比对、构建进化树。进化分析表明,植物GS可以分成胞质型(GS1)和质体型(GS2)两大类,GS1可进一步分成分5个亚类,包括双子叶植物为主的I、II和III亚类、低等植物类(IV)和单子叶植物类(V)。这5亚类中,第II类是豆科植物特有的一类,大豆的4个GS1 (GmGS1β1/2和GmGS1γ1/2)属于该亚类;利用qPCR在大豆盛花期分析GS1基因的组织表达特异性,结果表明不同类型GmGS1基因在表达部位和表达丰度上存在较大差异,而同一类基因之间具有相似的表达规律;4个豆科植物特有的GS1基因在大豆根瘤中都有较高的表达量,其中位于大豆第18染色体上的GmGS1β2基因表达丰度最高;利用原核表达系统体外表达GmGS1β2蛋白,诱导出分子量大小与理论预测值一致的目标蛋白,酶活性分析表明GmGS1β2可以与底物发生催化反应,具有谷氨酰胺合成酶活性,推测该基因在大豆根瘤氮素同化代谢中具有重要作用。     

鲁麦14对山东新选育小麦品种的遗传贡献

为了解骨干亲本鲁麦14对山东新选育小麦品种的遗传贡献,对鲁麦14及其6个衍生品种(系)进行了全基因组SSR扫描分析。在350个SSR位点上共检测到662个等位变异,每个位点1~5个等位变异,平均1.9个, 位点平均多态性指数(PIC)为0.21。UPGMA聚类分析表明,济麦22和鲁麦14聚为一类、青丰系列4个品种(系)聚为一类,这两类形成一个大的分支,而济麦20与这些品种的关系较远。在所检测的350个位点中,与鲁麦14相同的位点数,济麦22有235个(67.1%), 济麦20有210个(60.0%), 青丰1号有229个(65.4%), 青农2号有247个(70.6%)。这些相同位点多数以一个大的染色体区段传递至子代,且有的区段在6个衍生品种(系)中共享,如5A的gwm304–barc360–gwm415–barc1区段和6D的barc196–gdm127–barc123区段等。济麦22在21条染色体上都有与鲁麦14相同的位点,但染色体间差异较大,相同位点比例超过70%的染色体有3A、4A、7A,2B、4B、7B、1D、3D和4D;相同位点比例最低的是3B,仅46%。同一连锁群上,位点之间多呈连续区段分布,大多与已发现的重要性状分布簇相吻合。因此认为,鲁麦14的优良遗传背景对济麦22有重要贡献。在育种实践中,除需关注重要基因的导入外,还应注意骨干材料主体背景的选择。