紫花苜蓿基因工程改良研究进展

紫花苜蓿(Medicago sativa)具有适应性强、蛋白含量高、适口性好和营养价值丰富等特点,是全球栽培面积最大的优良牧草。随着生物技术的快速发展,利用基因工程改良紫花苜蓿已成为国内外研究的热点。本文就紫花苜蓿载体介导法、DNA直接导入法和种质系统介导法三类转化方法和抗生物胁迫、抗非生物胁迫、抗除草剂、品质改良及生物反应器开发五方面的转基因与遗传改良研究进行了全面的综述与分析,并对其应用前景及相关安全性等问题进行了展望,以期为紫花苜蓿基因工程改良的后续研究提供参考与借鉴。     

紫花苜蓿基因工程研究进展

牧草基因工程是近年来国内国际研究的热点之一,紫花苜蓿是世界范围内栽培历史最悠久、面积最大、研究最深入的优良豆科牧草,以其品质好、产量高而被誉为“牧草之王”。本研究结合国内外苜蓿基因工程研究动态,从生物胁迫、非生物胁迫、品质改良等方面系统介绍了苜蓿转基因研究的主要内容,在对已有成果进行综合分析的基础上,就目前苜蓿基因工程研究中亟待解决的一些问题进行了探讨。     

干旱和高温胁迫下紫花苜蓿PEPC酶活性变化及其基因序列分析

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种分布极其广泛的多年生优质豆科牧草，分析干热胁迫下其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)酶活性变化及PEPC蛋白的生物信息学。本研究以‘阿尔冈金’紫花苜蓿和云南德钦县野生紫花苜蓿为材料，测定其在干旱胁迫和高温胁迫下的PEPC酶活性的变化，同时扩增了PEPC基因，并对PEPC蛋白进行了生物信息学分析和系统发育分析。结果表明，在胁迫第12 h酶活性达到峰值，两种胁迫下野生紫花苜蓿的酶活性基本高于‘阿尔冈金’紫花苜蓿，两种紫花苜蓿PEPC蛋白均为不稳定蛋白和亲水性蛋白。干旱胁迫与高温胁迫都对紫花苜蓿PEPC酶活性产生了较大的影响，且两种紫花苜蓿PEPC氨基酸序列保守性均较高。本研究可为提高高温和干旱条件下紫花苜蓿的光合特性进而增加产量提供理论依据。     

水稻金属硫蛋白基因(rgMT)遗传转化的紫花苜蓿耐盐性分析

采用根癌农杆菌介导法将从水稻(Oryza sativa)中克隆出的一个金属硫蛋白基因(rgMT)转化到紫花苜蓿(Medicago sativa)品种"农菁1号"中,经PCR和Northern blot技术对获得的抗性植株进行了检测,证明rgMT基因已整合到苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。以野生型苜蓿为对照,对获得的转基因苜蓿株系在不同浓度NaCl、NaHCO3胁迫下的表型和生理指标测定发现,NaCl、NaHCO3胁迫处理后,野生型苜蓿受胁迫严重甚至死亡,转基因苜蓿受胁迫较轻。转基因苜蓿的脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性显著高于野生型(P0.05),细胞膜透性显著低于野生型,野生型苜蓿叶片中积累的过氧化氢高于转基因苜蓿的叶片中积累的过氧化氢。研究结果表明,rgMT基因已在苜蓿中表达,并且提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

紫花苜蓿响应低温胁迫转录因子的鉴定及表达分析

研究证明,转录因子广泛参与植物的生长发育过程并响应多种生物/非生物胁迫信号途径。低温胁迫可导致紫花苜蓿(Medicao sativa)减产、越冬率降低以及生产年限缩短。利用新一代高通量转录组测序技术,本研究对4℃低温胁迫下紫花苜蓿中响应低温胁迫的转录因子基因进行了鉴定,并对其表达情况进行分析,结果表明,转录组测序共获得78 925条Unigene序列和3 448个差异表达基因。其中,从3 448个差异表达基因中共鉴定出43个转录因子家族,共251个基因被显著地诱导表达。不同转录因子家族基因受低温胁迫诱导表达不同。本研究有助于在整体水平加深了解紫花苜蓿转录因子表达特性,为进一步研究这些响应低温胁迫的转录因子的功能提供参考。     

生物炭与干旱胁迫对接种紫花苜蓿光合效率及生长的影响

试验以接种根瘤菌‘Sm1021’的紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为材料,将土壤和生物炭按比例混合（0%,0.5%,1%,1.5%,2%）,然后进行不同程度（正常土壤水分处理,轻度,中度,重度）干旱胁迫,旨在研究土壤中添加不同水平生物炭与干旱胁迫对接种根瘤菌紫花苜蓿光合效率及生长的影响,探讨生物炭多孔性特性是否能够提高根瘤菌固氮能力,从而促进苜蓿生长。结果表明：干旱胁迫显著抑制紫花苜蓿的光合效率和生长（P<0.05）,重度干旱抑制作用最显著（P<0.05）;添加生物炭能够提高接种紫花苜蓿光合效率,促进植株生长;随生物炭水平升高,紫花苜蓿光合效率和生物量先增加后降低。研究认为,添加0.5%~1%水平的生物炭可增加接种紫花苜蓿叶面积,促进光合效率,缓解干旱胁迫对植株造成的伤害,从而促进生长。     

紫花苜蓿耐热性研究进展

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)被称为"牧草之王",因其产量高、品质好、适口性优、适应性强,是奶牛饲养业和草食畜禽的主要饲草来源。在我国南方地区,高温热害是紫花苜蓿推广利用的主要限制因子,对紫花苜蓿的正常生长、产量和品质造成严重影响。本文综述了高温胁迫对紫花苜蓿细胞膜系统、渗透调节系统、抗氧化防御系统及光合系统的影响,并对紫花苜蓿耐热机制的研究方向进行了展望,以期为进一步探究紫花苜蓿的耐热性提供参考。     

转MsLEA4-4基因拟南芥株系的耐盐性分析

为了深入研究紫花苜蓿（Medicago sativa）MsLEA4-4基因的抗逆性，本试验对前期获得的转MsLEA4-4基因的拟南芥（Arabidopsis thaliana）株系进行不同浓度盐胁迫处理，以验证MsLEA4-4基因在拟南芥植株体内的耐盐性。试验结果表明：盐胁迫后转基因株系的发芽率达到55%，比对照植株（Control plant，CK）高81%；转基因株系的鲜重、叶绿素含量均高于CK（P<0.05）；盐胁迫后转基因株系的存活率比CK提高75.0%~81.3%；盐胁迫明显抑制根系生长，但转基因植株的侧根数量比CK多4~5根（P<0.05）；盐胁迫后转基因株系体内的可溶性糖含量（P<0.05）和超氧化物歧化酶（P<0.01），过氧化氢酶（P<0.01），过氧化物酶（P<0.05）活性均高于CK，脯氨酸（P<0.01）和丙二醛（P<0.05）含量均低于CK。综上可得，MsLEA4-4基因参与了拟南芥体内的耐盐性调控，提高了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。本研究为进一步探索MsLEA4-4在转基因紫花苜蓿盐胁迫中的功能及培育耐盐性紫花苜蓿品种提供依据。     

日本结缕草ZjADH基因对拟南芥的转化及其耐寒性分析

为研究日本结缕草ZjADH基因是否与植物耐寒有关,通过DNA重组技术将ZjADH基因插入3302Y质粒中,成功构建了植物表达载体3302Y-ZjADH,通过农杆菌介导的花序侵染法获得具有草铵膦抗性的转基因植株。PCR和qRT-PCR鉴定表明,目的基因已整合入拟南芥基因组中并能够成功表达。对野生型和转基因拟南芥进行低温(4 ℃)处理和耐寒分析,结果表明,转基因拟南芥对低温胁迫的抵抗能力明显高于未转基因植株。在低温胁迫下,转基因拟南芥中脯氨酸的含量显著高于野生型植株,而活性氧的积累明显低于野生型植株;对转基因植物抗性相关基因的表达分析显示:转基因植物体内SOD、APX及LEA基因的表达水平明显高于未转基因植株,说明ZjADH基因可能通过提高转基因植物体内SOD、APX及LEA的表达活性来增强植物的抗寒性。综上所述,日本结缕草ZjADH基因的表达能够提高转基因植株的耐寒性,对ZjADH基因的研究也为进一步获得抗寒转基因日本结缕草植株奠定理论依据。     

紫花苜蓿抗热性鉴定与评价的研究进展

紫花苜蓿Medicago sativa因其营养丰富被广泛栽培,已成为草食家畜和奶牛养殖业的重要饲草,更是一种重要的生态改良草,在我国畜牧业发展和生态保护中起着不可比拟的作用。高温是影响紫花苜蓿生长的重要限制因子,研究发现高温胁迫致使植物发生一系列生理、生化及形态上的响应。在河南省,由于夏季高温的胁迫,致使紫花苜蓿夏眠,甚至死亡,严重影响其品质和产量。结合植物自身的调节机制,从植物形态及抗氧化系统综合阐述了高温条件下紫花苜蓿的抗热性鉴定方法和评价指标,旨为其抗热性鉴定和选育工作提供一定的科学参考。     

转Bar基因紫花苜蓿杂交组合的筛选与评价

为探究抗除草剂转基因紫花苜蓿（Medicago sativa）的高效杂交种选育技术。本试验以‘公农1号’作为父母本配置了1个对照组合,以转Bar基因的抗草铵膦除草剂转基因紫花苜蓿作为父本,以雄性不育系MS-GN-1A作为母本,配置了11个杂交组合。对后代植株的抗性进行Bar试纸条、PCR检测,对产量和品质性状进行评价和筛选,结果表明,试验中有7个杂交组合的后代表现优异。此试验以紫花苜蓿雄性不育系作为母本配置杂交种,使抗除草剂转基因紫花苜蓿的目标性状高效且稳定遗传,同时在此试验基础上筛选出了优良杂交后代,为良种繁育提供了一定的理论基础。     

农杆菌介导的smt1富硒基因转化紫花苜蓿研究

利用遗传转化,将硒富基因转入紫花苜蓿（Medicago sativa）是提高苜蓿富硒能力,解决当前硒不足问题的有效途径之一。本研究以“中苜1号”紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将来自硒超富集植物二沟黄芪(Astragalus bisulcatus)的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因(smt1)转入苜蓿,并以3 mg·L-1潮霉素进行筛选,获得转化植株10株。结果表明,5株均能扩增出与smt1基因大小相符的条带。RT PCR检测结果表明,2株目的基因表达呈阳性,这表明smt1基因已成功转入紫花苜蓿基因组中,且可以在植株中正常表达。     

过量表达紫花苜蓿MsHB7基因对拟南芥耐旱性的影响

同源异型域-亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）第I类亚家族在植物非生物胁迫调控过程中起着重要作用,已在多个物种中进行了克隆鉴定,但关于紫花苜蓿该家族基因的研究还鲜有报道。本研究旨在研究紫花苜蓿HD-Zip第I类亚家族基因MsHB7对拟南芥抗旱性的调控功能。通过克隆得到大小为738 bp、编码245个氨基酸的MsHB7基因的开放阅读框。多重序列比对和系统进化树分析结果显示,MsHB7蛋白属于HD-Zip I亚家族,且与拟南芥中ATHB7和ATHB12亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,MsHB7基因受干旱诱导。将MsHB7基因转化拟南芥并获得了阳性植株。干旱处理后,转基因拟南芥比野生型拟南芥萎蔫程度更明显,转基因植株相对含水量显著低于野生型拟南芥,并积累了更多的脯氨酸和丙二醛。qRT-PCR检测发现处理之后逆境胁迫指示基因ATCAT1、 ATDREB2A和ATRD29A在转基因拟南芥中的表达量显著升高,而ATLEA3的表达量显著下降。上述结果表明MsHB7基因的过表达可降低转基因拟南芥的耐旱性,为进一步开发利用该基因提供理论依据。     

苜蓿质量预测方法研究进展

苜蓿(Medicago sativa)质量是影响苜蓿干草价格的重要因素,而适时收获是把握苜蓿干草质量的重要环节。在科学种植管理条件下,对田间苜蓿质量提前判断,对准确收获目标质量苜蓿干草、保证经济效益意义重大。苜蓿产业较为发达的美国常用GDD和PEAQ法来预测田间苜蓿质量,以判断春季苜蓿的收获时间。当GDD为700～750时(5℃以上积温),苜蓿的NDF含量接近40%,当GDD增加220(7d后),NDF含量达到45%;PEAQ法中指出,NDF和ADF含量可以通过在具有随机样方中茎秆最高植株的茎长测量和判断样方中最成熟植株的成熟度来预测。GDD和PEAQ法对杂草较少、长势健康的苜蓿田生产质量预测比较准确。     

干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究

为探明干化的体细胞胚作为转基因苜蓿(Medicago sativa)人工种子的可行性,采用农杆菌菌株GV3101 感染苜蓿叶柄的遗传转化方法,获得转化苜蓿植株并诱导转化出苜蓿植株的体细胞胚。将成熟的子叶期体细胞胚先置于含10 mM脱落酸的胚形成培养基BOi2Y中培养14 d,然后将胚置于一系列的6种干燥剂中缓慢干燥7 d,最后将胚转到1/2MSO萌发培养基中,直到茎叶萌发和根形成。分析不同转基因株系干化人工种子的萌发率和再生植株中的GUS表达,并利用Southern杂交分析转基因干化人工种子再生植株的遗传变异。结果表明:干化后的转基因人工种子萌发率达到74.3%,产生的植株从形态上相似于没有干化处理的体细胞胚再生植株。在随机的3个转基因株系中,Southern杂交结果表明再生植株仍能稳定表达GUS,每个株系基因整合位点一致。因此,干化体细胞胚用作转基因植物种质保藏的方法是有效可行的。     

转基因苜蓿研究进展

就苜蓿基因工程在育种上的研究、转基因技术在苜蓿上的进展做了简要介绍。     

转BADH基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的NaCl对转BADH基因苜蓿T1代2个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,2个株系的T1代PCR阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在0.8%NaCl胁迫下,转基因植株Northern杂交表达量明显增加,BADH酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加2～4和4～5倍;不同浓度NaCl胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的BADH基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。     

转基因苜蓿研究的现状和前景

简要综述了紫花苜蓿转基因研究的现状,介绍了外源基因转化苜蓿和构建转基因苜蓿植株的手段以及转基因苜蓿研究中的常见问题,展望了转基因苜蓿应用的前景,讨论了苜蓿转基因育种中的生物安全问题。     

苜蓿在奶牛生产中的应用进展研究

苜蓿是一种优质的奶牛饲草来源,具有非常高的营养价值。本文对从苜蓿产业的发展历史、趋势和苜蓿的营养学特性、加工工艺以及在奶牛生产中的应用情况等方面进行了综述,并展望了苜蓿产业的发展前景。     

碱胁迫应答基因GsARHP的克隆及转基因紫花苜蓿的耐碱性分析

本研究基于实验室前期野生大豆碱胁迫转录组数据,筛选出一个碱胁迫下上调表达的假定蛋白基因,暂命名为GsARHP(alkali stress related hypothetical protein gene)。首先利用Real-time PCR方法验证了GsARHP基因受碱胁迫诱导表达。生物信息学分析表明,该基因编码一个含有130个氨基酸的亲水蛋白,含有信号肽但无跨膜结构域;构建了GsARHP植物超量表达载体,利用农杆菌介导的子叶节侵染法转化肇东紫花苜蓿,通过PCR,Southern Blot和RT-PCR方法检测获得了3个超量表达GsARHP基因的转基因株系,并对其耐碱性进行了分析。结果表明,在0,100和150 mmol/L NaHCO₃处理14 d后,非转基因株系明显萎蔫、黄化甚至死亡,而转基因株系则长势良好;进一步分析其生理指标显示,相对质膜透性与丙二醛含量均显著低于非转基因株系(P<0.01),而叶绿素含量与CAT活性显著高于非转基因株系(P<0.01),说明GsARHP基因的超量表达可以增强紫花苜蓿的耐碱能力。