家蚕sirtuin家族基因的鉴定及系统发生与表达芯片分析

【目的】鉴于sirtuin家族基因重要而多样性的功能,从家蚕全基因组中鉴定sirtuin家族基因,并进行基因结构、蛋白结构及其理化性质、基因进化、组织表达芯片分析及在不同组织中的定量表达情况分析,为研究家蚕sirtuin家族基因的功能和推动家蚕模式生物系统化的研究奠定基础。【方法】基于家蚕基因组数据库,通过生物信息学手段,利用比较基因组学方法,鉴定家蚕sirtuin家族成员;开放阅读框（ORF）的预测用ORFfinder进行;使用SIM4进行ORF的内含子和外显子的预测;用GSDS和ExPaSy在线工具分别进行基因结构图和蛋白序列理化性质的预测;用CLUSTAL_X软件进行多序列联配及对其二级结构进行分析,并用ESpript进行二级结构作图;使用SMART在线软件进行蛋白功能域预测;MEGA5.0软件用于系统发生树分析;利用已有的家蚕幼虫5龄第3天的芯片数据进行组织表达分析;利用荧光定量PCR技术检测家蚕sirtuin家族基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达情况。【结果】系统分析鉴定了家蚕中存在的5个sirtuin家族基因（Bmsirt2、Bmsirt4、Bmsirt5、Bmsirt6、Bmsirt7）,共分为4类（I、II、III、IV）。5个基因分布在家蚕5条染色体上,均为单拷贝基因。基因结构分析显示5个基因均为多外显子基因。同源比对和系统进化分析发现家蚕的sirtuin家族基因与类群中其他昆虫的同源基因形成明显的直系同源关系且高度同源,同样不含有sirt3。蛋白结构预测发现家蚕的sirt6与其他物种的sirt6蛋白一样含有两个sir2结构域聚在一起。组织表达芯片分析发现,sirtuin家族基因在多个组织中具有转录活性。荧光定量PCR检测结果显示家蚕的Bmsirt4在脂肪体、丝腺中低表达;Bmsirt5在精巢、中肠中高量表达,在脂肪体、血液、丝腺中低量表达,与芯片数据基本一致。【结论】通过全基因组分析,家蚕共有5个sirtuin家族成员,进化上分为4类,且与其他昆虫高度同源,芯片数据和实时荧光定量 PCR 结果基本一致,分析表明组织表达模式具有多样性。     

甘蓝脂质转运蛋白基因BoLTP的克隆与表达分析

[目的]克隆甘蓝脂质转运蛋白基因(BoLTP)的cDNA及DNA片段,为进一步研究其生物学功能奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中脂质转运蛋白基因的信息,克隆甘蓝不同组织BoL TP基因,对其核酸序列及预测蛋白进行生物信息学分析;检测甘蓝多种组织中BoLTP的表达情况.[结果]克隆获得甘蓝BoL TP的cDNA序列为720 bp,无内含子,编码102个氨基酸.生物信息学分析发现,甘蓝BoLTP具有脂质转运蛋白家族共有特征,具有显著的疏水区,并存在信号肽结构域、AAI结构域.RT-PCR检测结果表明,BoL TP主要在甘蓝雄蕊中表达,在雌蕊、萼片、花瓣、花茎及叶片中均无表达.[结论]甘蓝BoLTP基因可能与甘蓝雄蕊中花粉的发育相关.     

蓖麻DNA甲基转移酶序列与基因表达分析

植物DNA甲基化是与调控基因表达、保护基因组免受逆境胁迫等相关的表观遗传现象,其中关键酶DNA甲基转移酶催化DNA序列维持甲基化和从头甲基化。本研究基于蓖麻全基因组、利用生物信息学分析方法、结合转录组数据和RT-PCR半定量表达分析,鉴别出蓖麻DNA甲基转移酶氨基酸序列的结构特征、系统发生和表达形式。结果如下:通过同源序列BLAST从蓖麻基因组数据库中获得8个DNA甲基转移酶基因;系统进化分析将8个蛋白分为4个亚家族:2个MET同源蛋白、2个CMT同源蛋白、3个DRM同源蛋白和1个DNMT2同源蛋白,进一步发现DNA甲基转移酶在系统进化上较为保守,分化发生在单双子叶植物分化之后;亚细胞定位分析发现8个DNA甲基转移酶都定位在细胞核中;蛋白结构域比对结果显示8个蛋白的C端催化结构域都有6个保守motif参与甲基化修饰催化功能,表明蛋白具有基本的催化甲基化功能,而N端调节功能域的差异将蛋白分为四类,其中Rc DNMT2缺少N端调节结构域;结合转录组数据和RT-PCR半定量表达分析发现蓖麻DNA甲基转移酶基因(除Rc DRM2外)在发育胚乳中相对其他检测组织高表达,推测是该时期的胚乳低甲基化诱导甲基化基因高表达。该结果有助于全面了解蓖麻DNA甲基转移酶特征及为从表观遗传深入开展蓖麻品种改良具有重要理论指导作用。     

沙柳SpsNAC005基因克隆及生物信息学分析

本研究以沙柳为材料,基于毛果杨、欧洲红皮柳的序列,采用同源克隆的方法获得沙柳SpsNAC005基因,利用生物信息学软件分析SpsNAC005基因序列、构建进化树、预测蛋白结构。结果显示,SpsNAC005基因的开放阅读框序列长度为927 bp,编码为308个氨基酸。生物信息学分析表明,SpsNAC005含有NAC基因家族的典型NAM结构域,具有A、B、C、D、E 5个保守亚结构域。SpsNAC005基因为亲水性蛋白,预测细胞定位在细胞核上,其可能作为转录激活因子在细胞核中行使功能。本研究为进一步探索NAC基因在沙柳抗逆胁迫调控中的机制研究提供了重要的科学依据。     

鸭YAP1基因编码区的克隆、生物信息分析及其组织表达特性

【目的】旨在克隆鸭YAP1基因,预测其蛋白结构、功能及其组织表达特性。【方法】以北京肉鸭为材料,采用RT-PCR技术克隆鸭YAP1基因CDS区,利用多种生物信息学分析软件预测其结构与功能,并应用荧光定量PCR检测其组织表达特性。【结果】结果表明:鸭YAP1基因CDS全长1 248bp,编码415个氨基酸,氨基酸水平上与鸡相似性最高,达99.7%;氨基酸序列分析发现鸭YAP1蛋白相对分子量为45 417.5Da,主要定位在细胞核,属水溶性蛋白,不属于分泌蛋白;预测鸭YAP1氨基酸含有磷酸化、糖基化位点各30个;含两个WW结构域,且不同物种间结构域较保守;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构呈弯曲状螺旋结构;荧光定量结果显示,YAP1在胰脏中表达量最高,肌肉组织中最低。【结论】鸭YAP1基因非常保守,结构、功能与哺乳动物具较高一致性。     

葡萄MPT基因家族鉴定与表达分析

线粒体磷酸转运体(mitochondrial phosphate transporter, MPT)基因家族是位于线粒体内膜上的一种重要的功能蛋白,负责将重要代谢底物无机磷酸通过线粒体内膜从细胞质转移到线粒体基质中,在细胞维持正常功能中起到了关键的生理作用。本研究利用生物信息学工具,系统地分析了葡萄MPT基因家族成员的进化关系、基因结构、蛋白质理化性质和保守基序,以及组织特异性表达和同源基因的相关性。结果表明,葡萄全基因组中鉴定出64个MPT家族基因。根据系统发育树可以分为7组,分布于19条染色体上,其中两对基因存在串联复制现象。保守基序分析表明,所有MPT家族成员都含有保守的Mito_carr结构域。组织特异性表达表明,VvMPT基因在果皮、花、叶中高表达。同源基因分析表明,葡萄VvMPT基因家族可能在花器官发育、维持离子浓度中起到了重要作用。     

北京鸭MC4R基因的克隆及其组织表达的差异

黑素皮质素受体-4(melanocortin receptor-4,MC4R)是黑素皮质素受体家族5个亚型(MCR1-5)之一,在控制食欲、体质量、能量平衡中有重要作用。本研究采用RT-PCR技术从北京鸭脑组织中克隆出鸭MC4R基因的编码区序列,分析其基因结构并进行功能预测,利用实时荧光定量进行组织差异表达研究。结果表明,鸭MC4R基因编码区全长996 bp,编码332个氨基酸,包括起始密码子ATG和终止密码子TAG;与鹅、鸡、小鼠、人的相似性分别为97%、95%、78%、80%;推导的氨基酸序列显示,鸭MC4R蛋白具有G蛋白耦联受体家族结构域;实时定量结果表明,MC4R基因在北京鸭各组织相对表达水平存在差异,其中在脑组织中表达最高,脾脏、心脏、腿肌、腹脂、肾脏次之,而在肝脏和肺脏中表达量最低。本试验为进一步研究鸭MC4R基因的生物学功能奠定了基础。     

猪全基因组范围ETS基因家族成员的鉴定、进化与表达分析

ETS转录因子家族在动物中广泛存在,参与细胞分化调控、细胞周期控制、细胞调亡等多个生物学过程。文章采用生物信息学方法系统分析猪ETS家族成员进化关系和调控图谱,结合RNA-Seq数据分析其组织表达规律。研究利用Pfam鉴定ETS保守结构域序列检索猪(Sus scrofa)蛋白序列,最终在猪基因组上鉴定得到23个ETS家族基因。分析ETS家族基因、蛋白一级结构和高级结构及亚细胞定位预测。基于最大似然法,构建ETS家族系统发育树发现,可分为11个子家族,子家族成员保守结构域、基因结构、理化性质相似。通过生信分析构建由ETS家族、靶基因和miRNA构成的基因调控网络,筛选出40个"ETS家族基因-miRNA-靶基因"前馈回路。转录表达谱提示ETS家族基因在成年公猪和母猪28种不同类型组织中均有表达,且ETS1基因在免疫组织(淋巴、脾脏)和外周血单核细胞中高表达,SPIC基因在免疫组织(淋巴、脾脏)高表达。研究结果为揭示ETS家族成员生物学功能奠定基础。     

毛果杨 RAV/PLC 基因生物信息学分析

【目的】利用生物信息学手段,对毛果杨(Populus trichocarpa)RAV/PLC基因编码蛋白质结构和特征进行预测。【方法】以PLC(Phospholipases C)为关键字在Phytozome数据库搜索毛果杨磷脂酶C基因序列,以RAV/PLC基因及其蛋白质序列为研究对象,利用多种生物信息学分析工具对其基因结构及蛋白功能进行分析。【结果】在毛果杨PLC编码基因中发现了一个可编码RAV和PLC结构域的特殊基因,该基因在Phytozome数据库中编号为Potri.018G109200,ORF区域长度为1 650 bp,编码549个氨基酸,预测分子量为62.72338 ku,理论等电点为9.16;该基因在茎中表达量最高,芽中表达量其次之根和叶中表达量较低。其编码蛋白包含1个AP2结构域、1个B3结构域和1个PLC-X结构域,AP2/B3结构域和PLC-X结构域之间可能存在一个跨膜区;启动子元件分析表明,RAV/PLC基因可能与光应答及激素应答相关;String软件预测RAV/PLC基因可能与MYB103、WRKY49、ABI5、DXS2存在功能关联;KEGG分析表明,该基因主要与RAV转录因子信号通路有关;同时利用同源建模方法获得了RAV/PLC的完整三维模型。【结论】通过对RAV/PLC基因结构和蛋白功能预测,为该基因克隆及参与信号通路分析提供参考。     

稻瘟病菌分泌复合物的生物信息学分析及MoSec15定位研究

利用稻瘟病菌分泌途径相关的调控因子分泌复合物进行生物信息学分析及相关基因定位初探．经同源比对获得稻瘟病菌中分泌复合物8个亚基的同源蛋白,通过在线工具分析蛋白结构域、构建系统进化树、预测亚细胞定位;利用公共数据库获得其在稻瘟病菌不同组织和发育阶段的表达情况;此外,亚细胞定位分析表明,稻瘟病菌分泌复合物亚基MoSec15可能定位于菌丝体的内膜结构中．     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

大鲵2个Sox基因HMG–box的克隆及分析

为探明Sox基因在物种进化中的保守性及其性别分型,以大鲵雌、雄个体为材料,参照Sox基因HMG-box保守区的序列,设计简并引物扩增,两因子均在雌、雄个体内得到217 bp PCR扩增产物,不存在性别差异.将二者编码的氨基酸序列与NCBI中其他物种Sox基因编码的氨基酸序列进行比对,其中一个基因与人、斑马鱼、家鼠、鸡、热带爪蟾、扬子鳄Sox11基因的同源性均为90％.另一个基因与罗非鱼、鸭嘴兽、家鼠、红鳍东方鲀、斑马鱼、鸡、人、非洲爪蟾和大鲵Sox14基因的同源性均为90％,故根据大鲵的学名,将这2个基因分别命名为adSox11和adSox14c.adSox11和adSox14c在大鲵精巢、卵巢、肾脏和心脏中均有不同程度表达,而在胃和肝脏中几乎不表达.     

肉鸡结直肠生长抑素2型受体(SSTR2)的分子克隆与发育性表达

 【目的】 获得肉鸡生长抑素2型受体（SSTR2）基因序列并进行序列分析；揭示不同基因型肉鸡结直肠SSTR2 mRNA表达的发育性变化并进行品种间比较。 【方法】运用RT-PCR和RACE方法进行肉鸡SSTR2序列扩增相对定量RT-PCR方法研究AA肉鸡和岭南黄肉鸡结直肠SSTR2 mRNA表达的发育规律。【结果】肉鸡SSTR2从起始密码子至Poly(A)长度为2311bp，其ORF与电子克隆序列完全相同，核苷酸序列与人SSTR2的同源性为81.0%，与大鼠SSTR2同源性为79.5%。其翻译的蛋白由371个氨基酸组成，比人和大鼠的SSTR2多2个氨基酸，鸡SSTR2与人的同源性87.1%，与大鼠的同源性为86.3%。AA肉鸡30d的SSTR2 mRNA表达丰度显著高于其他日龄（P＜0.05）；2d、16d、44d和58d差异不显著（P＞0.05）。黄羽肉鸡的16 d的SSTR2 mRNA表达丰度显著高于30 d、44 d和58 d（P＜0.05），2 d、30 d、44 d和58 d之间差异不显著（P＞0.05）。不同基因型SSTR2 mRNA表达丰度比较显示，AA肉鸡30 d、44 d和58 d均显著高于黄羽肉鸡（P＜0.05）。【结论】不同物种间SSTR2具有较高的同源性；不同基因型肉鸡结直肠SSTR2 mRNA表达的发育模式不同，AA肉鸡生长后期 SSTR2 mRNA表达丰度显著高于黄羽肉鸡。     

Q型烟粉虱化学感受蛋白基因BtabCSP1的克隆与分析

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究该类基因功能奠定基础。【方法】根据桃蚜化学感受蛋白OS-D2a（ABM5558）的氨基酸序列,借助生物信息学搜索烟粉虱EST序列拼接了1个烟粉虱化学感受蛋白基因（BtabCSP1）,以烟粉虱mRNA为模板,采用RT-PCR扩增克隆烟粉虱化学感受蛋白cDNA。采用半定量RT-PCR对不同发育阶段的烟粉虱样品中BtabCSP1的表达模式进行研究。【结果】BtabCSP1完整阅读框全长为2 626 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码131个氨基酸残基,其中含有1个CX6CX18CX2结构域,为化学感受蛋白的典型特征。BtabCSP1在供试样品中均有表达,并且在2龄、3龄和伪蛹阶段表达量更高。聚类分析结果表明,烟粉虱与果蝇、桃蚜等物种遗传关系较远,化学感受蛋白基因在物种进化过程中较为活跃。【结论】从Q型烟粉虱若虫中克隆了1个化学感受蛋白基因 BtabCSP1,该基因在烟粉虱不同发育阶段中均能表达,推测其对烟粉虱的生长发育具有重要的调控作用。     

鸡CaBP-D28k基因重组质粒构建

    为构建pCEP4-CaBP-D28k真核表达载体,根据GenBank已发表钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)设计1对引物,利用RT-PCR方法获得新扬州鸡CaBP-D28k基因序列,克隆入真核表达载体pCEP4,经PEI介导转入非洲绿猴转化肾细胞(COS-1)中,并以间接免疫荧光试验(IFA)检测CaBP-D28k表达状况.结果表明,CaBP-D28k基因核苷酸长度为789 bp,编码261个氨基酸,与GenBank上已发表序列比较,核苷酸同源性为99.9%,在第760位处存在G→T的错义突变.该序列与蟾蜍、鼠、人CaBP-D28k氨基酸同源性分别为79.7%、78.2%、78.6%;酶切和测序鉴定证实pCEP4-CaBP-D28k含有目的片段,且连接构建正确;在COS-1细胞中检测到CaBP-D28k表达.这为进一步研究pCEP4-CaBP-D28k在动物体中的表达,调控机体钙代谢奠定了基础.     

鸡干扰素调节因子7的分子特征及其组织表达特性分析

【目的】明确鸡干扰素调节因子7 （chIRF7）的分子特征及chIRF7基因在不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展IRF7基因调控鸡相关组织发育和抗病毒研究打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增chIRF7基因编码区（CDS）并构建其重组真核表达载体,通过SOPMA、SWISS-MODEL及BioEdit等在线软件预测分析chIRF7蛋白的二、三级结构及结构域保守性;以重组真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞系（DF-1）,观察融合蛋白的亚细胞定位情况及分析过表达融合蛋白对新城疫病毒（NDV）复制的影响;采用实时荧光定量PCR检测chIRF7基因在鸡胚发育第14 d（E14d）及鸡出壳第1 d（H1d）、第7 d（H7d）和第14 d（H14d）不同组织中的表达情况。【结果】将从鸡外周血淋巴细胞中扩增获得的chIRF7基因CDS序列插入真核表达载体pEGFP-C1的酶切位点即成功构建获得重组真核表达载体pEGFP-chIRF7。chIRF7蛋白二级结构由无规则卷曲（占51.12%）、α-螺旋（占26.48%）、延伸链（占16.70%）和β-转角（占5.70%）组成;鸡与其他禽类、人类和哺乳动物的IRF7氨基酸序列相似性均较低,且5个功能结构域不保守。经聚肌胞苷酸［Poly （I:C）］或NDV处理DF-1细胞后,可使融合蛋白EGFP-chIRF7由细胞质定位转变为细胞核定位;而在细胞内过表达融合蛋白EGFP-chIRF7可降低NDV的复制能力和细胞致病性。chIRF7基因在鸡不同发育阶段各组织中均有不同程度的表达,且以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和腺胃,在腿肌中的相对表达量较低;从E14d发育到H14d,chIRF7基因在肺脏中的表达呈先下降后趋于稳定的变化趋势,在肝脏、腺胃、心脏和腿肌中呈先下降后上升再下降的变化趋势,在脑组织中呈先稳定再下降的变化趋势,在胸肌和眼球中的表达则趋于稳定。【结论】 IRF7在不同物种中的相似性较低且结构域不保守,经外界刺激诱导表达的chIRF7会发生细胞核移位而具有抗病毒感染效果。IRF7基因在鸡不同发育阶段的肺脏、肝脏和腺胃中高表达,说明对这3个组织的发育可能具有调控作用。     

民猪NUMB基因克隆与组织表达分析

研究采用RT-PCR技术结合克隆测序方法,克隆出全长2 004 bp NUMB基因序列,其中包括1 782 bp开放读码框,该基因编码592个氨基酸。利用生物信息学分析软件对该基因氨基酸序列预测与分析发现:NUMB蛋白二级结构中,转角占很大比例,且蛋白亲水性较强,结构功能域分析发现该蛋白多肽链存在一个N端磷酸酪氨酸结构域(PTB),位于第37~162氨基酸之间。基于不同物种NUMB蛋白序列所构建分子进化树表明,猪与牛、骆驼亲缘关系最近,而与斑马鱼最远。在m RNA水平上,NUMB基因肺中表达量最高,大肠中表达量最低。     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coli JM109,检测阳性克隆并测序.猪FSP27基因的cDNA序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-72Top,编码有238个氨基酸.同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%.氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3%.组织分布结果显示:猪FSP27基因在多种组织均有分布.克隆的猪FSP27基因并注册GenBank(Accession.EU395789).     

鸭IL-18基因克隆与序列分析

[目的]为深入研究鸭IL-18的基因表达及其生物学活性和分子佐剂的应用奠定基础。[方法]依据GenBank中香港鸭IL-18基因的序列设计1对特异引物,以广东水鸭脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆广东水鸭IL-18基因并进行序列分析。[结果]测序结果表明,广东水鸭的IL-18基因开放阅读框为603 bp,编码201个氨基酸,分子量为23.2 kDa。序列分析表明,所获得的广东水鸭IL-18基因与GenBank中香港鸭的核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为100%。它与鸡和火鸡的核苷酸同源性分别为86.9%和87.1%,而氨基酸同源性分别为96.5%和97.0%。[结论]进化树分析结果表明,鸭IL-18基因与鸡和火鸡进化关系较近。