欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列分析及原核表达#br#

【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a（+）中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21（DE3）中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR 获得的cDNA 全长包含完整的cDNA开放读码框732 bp,编码244个氨基酸,命名为MsMYB10。MsMYB10分子量为28.56 kD,等电点为8.41,GenBank登录号为GQ500894。该蛋白具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有1个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知MdMYB10的氨基酸序列的同源性为98%。另外,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因, 并可在大肠杆菌中转化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD,等电点为7.42,信号肽为N端24个氨基酸残基,具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明,该基因明显区别于其它pgip,与马哈利樱桃pgip的关系较近,与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长包含完整的cDNA开放读码框732bp,编码244个氨基酸,命名为MsMYB10。MsMYB10分子量为28.56kD,等电点为8.41,GenBank登录号为GQ500894。该蛋白具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有1个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知MdMYB10的氨基酸序列的同源性为98%。另外,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因,并可在大肠杆菌中转化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

甜樱桃GalDH、Gal LDH的克隆及在果实发育过程的表达

【目的】探究GalDH和GalLDH在甜樱桃果实AsA生物合成中的作用。【方法】本研究以甜樱桃‘佐藤锦’(Satonishiki)果实为材料,采用改良CTAB法提取总RNA,运用RT-PCR法,克隆并分析了抗坏血酸L-半乳糖合成途径PacGalDH和PacGalLDH基因的cDNA全长序列。此外,采用实时荧光定量PCR分析了两基因在甜樱桃果实发育过程的表达。【结果】获得了1 253 bp长的PacGalDH cDNA序列,其中含有975 bp完整的开放阅读框(ORF),编码324个氨基酸残基。获得了1 914 bp长的PacGalLDH c DNA序列,含有1 791 bp完整的ORF,编码596个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,PacGalDH和PacGalLDH氨基酸序列均与梅和桃对应的氨基酸序列具有较高的同源性,达98%。实时荧光定量PCR分析表明,PacGalDH和PacGalLDH在甜樱桃果实不同发育阶段均有表达,均在花后10 d达到最大表达量,随后逐渐下降。并且,果实总抗坏血酸(T-AsA)含量在花后0 d最高,达44.7 ng/g,此后呈下降趋势。【结论】在果实生长发育过程中,PacGalDH的表达量变化与T-AsA水平变化趋势基本一致,初步推测PacGalDH可能是甜樱桃AsA生物合成的关键酶。     

苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测。【结果】苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

亚洲玉米螟GOBP2的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

 【目的】克隆、序列分析和原核表达亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）GOBP2（OfurGOBP2)的cDNA。【方法】以亚洲玉米螟触角为材料,采用RT-PCR结合RACE方法克隆OfurGOBP2的cDNA序列,并在pGEX-4T-2/BL21（DE3）系统中进行原核表达, 进一步利用制备的抗体检测OfurGOBP2蛋白。【结果】从亚洲玉米螟触角中获得了GOBP2的cDNA序列（GenBank登录号为DQ673101）,序列分析表明,OfurGOBP2开放阅读框489 bp,编码162个氨基酸残基,氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征。一致性分析显示,OfurGOBP2与其它鳞翅目昆虫GOBP2编码的氨基酸一致性较高,表明昆虫的GOBP2在分子进化过程中是保守的。进一步将OfurGOBP2与表达载体pGEX-4T-2连接,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为41 kD的可溶性融合蛋白。SDS-PAGE分析和Western印迹检测结果表明,OfurGOBP2能够高效表达,并与预测的融合蛋白分子量相符。利用制备的多克隆抗体对亚洲玉米螟GOBP2进行Western-blot分析,证明其能够特异识别OfurGOBP2蛋白。【结论】成功克隆了编码并表达亚洲玉米螟气味结合蛋白GOBP2 的cDNA序列,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究亚洲玉米螟GOBP2的结构和功能。     

外源GA3和ABA处理对红肉脐橙果实品质的影响

以生长性状一致的成年红肉脐橙为试材,研究了果实转色前外源GA3和ABA处理对其品质的影响,结果表明:GA3处理提高了果皮的亮度,但降低了果皮红色度和单果重;外源ABA提高了果皮的红色度和黄色度,但降低了果皮的亮度和单果重;外源GA3与ABA处理均不利于果实内在品质的提高,从而在果实转色前用外源ABA和GA3处理红肉脐橙果实不利于其综合品质的提高。     

红肉脐橙落花落果规律的观察研究

2008年对红肉脐橙生理落果进行观察研究,以揭示其落花落果规律,为制定保花保果技术措施提供依据。结果表明：红肉脐橙落蕾落花时间集中在4月上中旬,4月12日出现明显的落蕾落花高峰,4月21日开始第1次生理落果,持续35d,于5月26日结束,其中5月4日和5月9日分别出现2次落果高峰;落花后18d,即5月11日开始第2次生理落果,至6月27日结束,持续47d,其中5月17～18日和6月9日分别出现2次落果高峰;红肉脐橙落花、第1次、第2次生理落果分别占总落花落果数的80．7％、16．8％和2．5％,坐果率为0．89％。生理落果以第1次生理落果为主,建议在谢花期、第10：生理落果高峰前的4月底或5月初,各喷施1次50×10^-6 GA3溶液保果,5月中旬第2次生理落果高峰前再喷施1次;红肉脐橙脐黄率为8．8％、裂果率为15．2％,裂果率偏高乃久旱骤雨所致。     

红肉脐橙果实发育过程中主要糖含量的变化

以气相色谱法测定了红肉脐橙(Citrus.sinensis (L) Osbeck cv.Cara Cara)果实发育过程中果肉和果皮的葡萄糖、果糖、蔗糖和总糖的含量变化,结果显示,红肉脐橙果肉中蔗糖主要在果实着色前积累,而葡萄糖和果糖主要于果实成熟期积累,成熟时果肉中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的比例约为1∶1∶2,表明红肉脐橙果肉以积累蔗糖为主;果皮蔗糖含量也于果实着色前迅速增加,着色期和成熟期逐渐下降,而葡萄糖和果糖于着色期以较快的速度积累,成熟期维持在稳定而较高的水平,成熟时果皮葡萄糖、果糖和蔗糖含量的比例约为2∶2∶1,表明成熟红肉脐橙果皮以积累己糖为主。     

GA_3和套袋对红肉脐橙果实品质的影响

以红肉脐橙为试材,于幼果期喷施不同浓度的GA3,并于第2次生理落果基本结束后对果实套袋,分析GA3和套袋处理对其品质的影响。结果表明:各GA3处理均极显著降低了单果重,显著或不显著地提高了果形指数、可溶性固形物、糖酸比和Vc含量,对果皮的亮度、黄色度、果皮厚度、可食率、出汁率、可溶性总糖和可滴定酸无显著影响;套袋处理显著或不显著增加了果皮亮度、黄色度和果形指数,但显著降低了果皮红色度、单果重、可溶性固形物、可溶性总糖和糖酸比,对其他品质指标没有显著影响。     

外源GA3对红肉脐橙果实品质及果皮着色的影响

以红肉脐橙(Citrus sinensis(L)Osbesk cv.Cara Cara)为试材,于2004年6月25日和9月25日分2次分别叶喷清水及10、50、250、500mg·L-1GA3,研究外源GA3处理对果实品质的影响及处理后果皮叶绿素和类胡萝卜素含量的变化。结果表明,在外观品质方面,各GA3处理有降低果皮亮度、红色度、黄色度和单果重的趋势,其中250mg·L-1和500mg·L-1的GA3处理分别极显著和显著降低了果皮红色度和黄色度,10mg·L-1和50mg·L-1的GA3处理极显著降低了单果重,各处理对果形指数和果皮厚度没有显著影响;在内在品质方面,10mg·L-1GA3处理极显著提高了果实可溶性固形物含量,显著提高了可溶性总糖含量和糖酸比,而500mg·L-1GA3处理显著降低了果实出汁率、极显著降低了可溶性固形物含量,但各处理对可食率、可滴定酸含量和维生素C含量没有显著影响;在果皮着色方面,较高浓度的GA3处理可延缓果皮叶绿素的降解,但同时阻碍了果皮类胡萝卜素的积累。     

红肉脐橙果肉中主要色素含量的变化及外源ABA和GA3对其含量的影响

用高效液相色谱法测定了‘红肉脐橙’果实发育期间果肉中番茄红素和β-胡萝卜素含量的变化,并对果实转色前用不同浓度的外源ABA处理后主要色素的含量进行了测定。结果表明,果肉中番茄红素和β-胡萝卜素的含量在果实成熟期达到最大值(分别为26.79和9.21 礸穏-1 FW),番茄红素和β-胡萝卜素分别在果实膨大期和果实成熟期2个时期迅速积累,β-胡萝卜素的合成较番茄红素滞后;5和20 mg稬-1的外源ABA处理能促进番茄红素的积累,但所有ABA处理都不能促进β-胡萝卜素的积累。     

不同温度贮藏红肉脐橙果肉主要色素和糖含量的变化及其相关性

研究了红肉脐橙果实贮藏过程中果肉主要色素和糖含量的变化。结果表明,室温贮藏的果实番茄红素含量为单峰曲线,于1月28日达到最大值,为47.19μg.g-1FW,β-胡萝卜素含量出现3次高峰,于3月23日达到最大值,为37.35μg.g-1FW;6℃冷库恒温贮藏的果实番茄红素含量高峰较室温贮藏滞后出现,且含量明显高于室温贮藏(2月17日,55.92μg.g-1FW),β-胡萝卜素含量变化趋势与室温贮藏基本一致,但高峰出现时间(1月28日)较室温贮藏滞后;6℃冷库恒温贮藏有利于贮藏前期(12月25日~1月28日)各种糖的积累,但不利于贮藏后期糖的积累(蔗糖除外)。     

红肉脐橙树体不同部位果肉主要色素和糖含量的变化及其相关性

研究了红肉脐橙树体不同部位果实果肉中主要色素和糖含量的动态变化,并对其相关性进行了分析.结果表明:内膛和外围果实的番茄红素和β-胡萝卜素含量变化趋势仅在果实着色后期和成熟期(11月10日至12月25日)有所不同,果实成熟时内膛果实的番茄红素含量极显著低于对照,但β-胡萝卜素含量极显著高于对照;内膛与外围果实的各种糖含量的变化趋势基本一致,但果实着色后期和成熟期(11月10日至12月25日)内膛果实的各种糖含量都显著或极显著低于对照(12月25日的蔗糖含量除外);外围果实的番茄红素、β-胡萝卜素、葡萄糖、果糖、蔗糖和总糖两两之间呈显著或极显著正相关关系,内膛果实的β-胡萝卜素、葡萄糖、果糖、蔗糖和总糖两两之间也呈显著或极显著正相关关系,番茄红素含量与其他指标之间呈正相关关系但不显著.     

生草栽培对橘园土壤肥力和红肉脐橙果实品质的影响

选取南北向种植的红肉脐橙结果树,设置白三叶草生草处理组和清耕种植对照组,生草栽培5a后(2015年),测定果园土壤速效矿质元素的变化,同时分析生草栽培4~5a后(2014-2015年)脐橙果实品质的变化。结果表明:与对照组相比,生草栽培5a后橘园土壤速效P和有效Fe的含量显著提高;生草栽培显著增加了单果质量、果形指数和可食率,其中,单果质量第4年增加15.71%,第5年增加28.98%;果皮厚度下降0.28mm(2014年)和0.18mm(2015年);果形指数提升了0.04;可食率提升2.3%(2014年)和2.1%(2015年);生草栽培对红肉脐橙可溶性固形物、可滴定酸和维生素C含量等内在品质无显著影响。白三叶草生草栽培能增强红肉脐橙果园土壤肥力,提高脐橙单果质量,改善果实品质,具有较好的生态和经济效益,适宜推广利用。