亮氨酸或组氨酸通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路影响奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成

本试验以永生化奶牛乳腺上皮细胞系为模型,单一添加不同浓度的亮氨酸或组氨酸,检测酪蛋白和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关基因的表达,旨在探讨亮氨酸和组氨酸通过mTOR信号通路影响酪蛋白合成的机制。以厄尔平衡溶液代替培养基,并设其为阴性对照,单一添加不同浓度的亮氨酸或组氨酸,分别采用噻唑蓝(MTT)比色法检测永生化奶牛乳腺上皮细胞12和24h的增殖;运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测4个酪蛋白编码基因和8个mTOR信号通路相关基因mRNA表达量。结果表明:分别添加不同浓度亮氨酸或组氨酸12和24h,细胞增殖趋势一致;与阴性对照组相比,分别添加0.15~5.40mmol/L亮氨酸或0.15~9.60mmol/L组氨酸,永生化奶牛乳腺上皮细胞的数量均增加。与阴性对照组相比,当分别添加0.45~10.80mmol/L亮氨酸6h时,αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)和κ-酪蛋白(CSN3)基因表达均显著上调(P0.05)。当添加0.15~4.80mmol/L组氨酸6h时,CSN1S1、β-酪蛋白(CSN2)和CSN3基因表达均显著上调(P0.05)。在试验组中,当亮氨酸浓度为1.35mmol/L时,mTOR信号通路相关基因mTOR、mTOR调控蛋白(raptor)、mTOR复合物1中的绑定蛋白(GβL)、信号下游因子真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)和真核细胞翻译延伸因子2(eEF2)基因表达量最高。而核糖体S6蛋白激酶(S6K1)基因的表达量随着亮氨酸浓度的增加而减少。当添加组氨酸时,下游信号因子4EBP1、eEF2、真核翻译起始因子4E(EIF4E)和核糖体蛋白S6(rps6)基因的表达量随着组氨酸浓度的增加而增加,mTOR基因的表达量随着组氨酸浓度的增加而减少。在试验组中,GβL的表达量在组氨酸的浓度达到4.80mmol/L时最高;S6K1基因表达量在组氨酸的浓度达到1.20mmol/L时最高。综上所述,在乳腺上皮细胞中,亮氨酸和组氨酸能通过mTOR信号通路促进酪蛋白合成相关基因的表达。     

L型氨基酸转运载体1对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的影响

为研究L型氨基酸转运载体1(L type amino acid transporter 1,LAT1)对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的作用,本试验采用PCR技术体外扩增奶牛LAT1基因并构建LAT1真核表达载体,采用脂质体转染技术将LAT1真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,并于转染48h后采用Western blotting技术检测LAT1过表达后乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达变化。荧光显微镜检测结果显示,LAT1真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞;Western blotting检测结果显示,LAT1过表达的奶牛乳腺上皮细胞中LAT1极显著增加(P0.01),β-酪蛋白的表达显著升高(P0.05),4F2hc表达变化不显著(P0.05)。这些结果提示LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用。     

亮氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞增殖及κ-酪蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在研究添加不同水平亮氨酸对乳腺上皮细胞体外增殖及κ-酪蛋白(CSN3)合成相关基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,以不含有亮氨酸的培养基为对照组(0×组),试验组培养基分别添加0.112 5(0.25×组)、0.225 0(0.5×组)、0.450 0(1×组)、0.900 0(2×组)、1.800 0(4×组)、3.600 0(8×组)、7.200 0(16×组)、14.400 0 mmol/L(32×组)的亮氨酸。试验采用噻唑蓝(MTT)比色法检测奶牛乳腺上皮细胞增殖;运用实时定量PCR检测CSN3合成相关基因相对表达量。结果表明:亮氨酸能够提高乳腺上皮细胞的相对增殖率。24和48 h时,除0.25×组外,其余各组与对照组相比细胞均差异均显著(P0.05);72 h时,各组与对照组相比差异均显著(P0.05);其中2×组的促增殖作用都达到最强。亮氨酸能够促进哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、转录激活因子5(STAT5)和CSN3基因的表达,抑制真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因的表达,其中2×组对m TOR、S6K1、JAK2、STAT5和CSN3基因的上调表达最强,而对4EBP1基因的下调表达最强。总之,添加亮氨酸能够促进奶牛乳腺上皮细胞增殖和CSN3合成相关基因(除4EBP1)表达,亮氨酸水平为0.900 0 mmol/L时,其促进作用均达到最大。     

葎草黄酮对牛乳腺上皮细胞相关基因表达的影响

以奶牛乳腺上皮细胞为细胞模型,用MTT法检测细胞的存活和生长情况,用不同浓度的黄酮溶液(0、100、200、400、600、800mg/L)刺激奶牛乳腺上皮细胞12h,再用相同浓度的黄酮溶液(400mg/L)作用于奶牛乳腺上皮细胞不同时间(1、4、9、12、16、24h),分别提取细胞总RNA,用荧光定量PCR法测定GHR、β-CN、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ泌乳相关基因的表达,研究葎草提取物总黄酮对乳腺上皮泌乳及炎性相关因子表达的影响。结果表明,试验组与空白组相比,奶牛乳腺上皮细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平降低(P0.05);生长激素受体(GHR)、β-酪蛋白(β-CN)的表达量高于对照组(P0.05)。说明葎草黄酮能上调奶牛乳腺上皮细胞β-CN和GHR的表达量,以浓度为400mg/L培养4h~12h的效果最佳。     

蛋氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

研究蛋氨酸与乳蛋白合成及乳腺泌乳能力的关系。建立体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型,采用高效液相色谱法、实时荧光定量PCR、细胞活力分析仪、甘油三酯试剂盒检测不同浓度蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mmol/L)对体外培养24h的奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响。结果表明,蛋氨酸在1.2mmol/L时对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的促进作用最明显,乳糖分泌量最高,β-酪蛋白mRNA表达量最高且甘油三酯合成最多(P<0.01)。     

不同浓度胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因表达的影响

应用Real-time PCR方法检测不同浓度(0、1、10和100 ng/mL)胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)处理后的体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因mRNA的相对表达量。结果表明,添加不同浓度IGF-Ⅰ对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞IGF-Ⅰ受体基因(IGFIR)、IGF-Ⅰ结合蛋白-3基因(IGFBP3)、α-s1-酪蛋白基因(CSN1S1)和κ-酪蛋白基因(CSN3)mRNA的相对表达丰度均无显著影响(P>0.05)。随着IGF-Ⅰ添加浓度的增加,β-酪蛋白基因(CSN2)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACACA)、脂肪酸合成酶基因(FASN)和脂肪酸结合蛋白-3基因(FABP3)mRNA的相对表达丰度显著上调(P<0.05)。提示,IGF-Ⅰ作为一种重要细胞因子参与调节乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪相关基因mRNA的表达。     

β-羟基丁酸通过激活TLR4/NF-κB通路诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应

旨在探究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子kappaB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)通路在β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHBA)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的分子作用机制。通过添加不同浓度的BHBA诱导奶牛乳腺上皮细胞MAC-T以模拟奶牛高酮血症中乳腺上皮细胞的炎性反应，并利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染细胞42 h后加入3.6 mmol/L BHBA再处理24 h;通过RT-qPCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)和IL-6等炎性因子的表达变化，并采用Western blot法测定TLR4/NF-κB通路关键蛋白的相对表达水平。结果表明，与对照组相比，不同浓度BHBA处理后，乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高，当BHBA浓度为1.2 mmol/L或以上时，p-NF-κB p65/NF-κB p65比值和TRAF6蛋白水平显...     

stat5高效表达对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

本研究旨在检验构建的stat5表达载体对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。构建真核表达载体pcD-NA3.1+-stat5-αS1,稳定转染到奶牛乳腺上皮细胞中。利用细胞活力分析仪、HPLC、Real-time PCR和WesternBlotting技术检测乳腺上皮细胞转染前后stat5基因和蛋白的表达量、细胞活力及乳糖和酪蛋白分泌情况。结果表明,与空白细胞和空白载体组相比,非磷酸化STAT5蛋白和stat5基因的表达量增加(P<0.01),乳糖含量提高(P<0.05),细胞活力和增殖能力增强(P<0.01),酪蛋白和磷酸化STAT5(pSTAT5)表达增多(P<0.05)。结果提示,构建的载体pcDNA3.1+-stat5-αS1在乳腺上皮细胞中高效表达,显著提高乳腺上皮细胞的泌乳能力。     

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白和乳糖合成的调节作用

本试验旨在研究蛋氨酸(Met)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳糖含量及乳蛋白和乳糖合成相关基因和蛋白表达的影响,探讨Met对乳蛋白和乳糖合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个组,每个组6个重复。Met终浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs活力、ATP含量、乳蛋白和乳糖合成相关基因和蛋白表达及细胞液中乳糖含量。结果表明:与0.13和0.78 mmol/L组相比,0.39～0.65 mmol/L组细胞活力显著增加(P 0.05),0.26～0.52 mmol/L组的葡萄糖转运蛋白1和α-乳清白蛋白的基因相对表达量显著下降(P0.05),0.39 mmol/L组乳糖含量显著增加(P0.05)。与0.13～0.26 mmol/L组相比,0.39～0.52 mmol/L组信号转导和转录因子5、真核起始因子4E基因相对表达量及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、核糖体蛋白S6激酶1磷酸化水平显著增加(P0.05)。0.52 mmol/L组ATP含量、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和酪氨酸激酶2基因相对表达量显著高于其他组(P0.05),但腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平显著低于其他组(P0.05)。0.26～0.52 mmol/L组的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因相对表达量显著高于0.65～0.78 mmol/L组(P0.05)。综合乳蛋白和乳糖合成的多项指标,0.39～0.52 mmol/L的Met对BMECs乳蛋白基因和蛋白表达及乳糖的合成促进效果较好。     

谷氨酰胺对离体培养的泌乳母猪乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白基因表达的影响

为探讨谷氨酰胺(Gln)在泌乳母猪乳腺组织的正常发育和泌乳功能中的调控作用,研究选用6头大白纯种母猪,于泌乳第21天,采集所有母猪具有正常泌乳功能的乳腺组织用于分离乳腺上皮细胞。采用RT-PCR方法鉴定该细胞为猪乳腺上皮细胞,且具有分泌β-酪蛋白的功能;将纯化后处于对数生长期的乳腺上皮细胞接种到培养板上,分别用含0.20、0.16、0.12、0.08、0.04、0.01、0 mmol/mL Gln的培养液进行培养,检测细胞增殖率及其β-酪蛋白表达量。结果表明:Gln添加量在0.08~0.16mmol/mL范围时可显著促进猪乳腺上皮细胞的增殖(P<0.05),且显著提高其β-酪蛋白表达丰度(P<0.05),其中以0.12 mmol/mL浓度效果最显著。结果提示,适宜浓度的Gln能促进泌乳母猪乳腺组织的发育,并能提高乳蛋白的合成量。     

漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成的影响

以体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞为模型,利用β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖/半乳糖检测试剂盒测定漏芦乙醇提取物处理的乳腺上皮细胞培养液中β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖含量;采用荧光定量RT-PCR检测β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖合成代谢相关酶和蛋白因子mRNA表达的变化。结果显示,25、50、100μg/ml的漏芦乙醇提取物以浓度依赖的方式显著提高乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖含量(P<0.05)及乳腺上皮细胞中乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的mRNA表达水平(P<0.05)。实验结果表明漏芦乙醇提取物能促进奶山羊乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖,并能提高乳腺上皮细胞乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的基因表达,进而影响奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

L型氨基酸转运载体1对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的影响

为研究L型氨基酸转运载体1（L type amino acid transporter 1,LAT1）对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的作用,本试验采用PCR技术体外扩增奶牛LAT1基因并构建LAT1真核表达载体,采用脂质体转染技术将LAT1真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,并于转染48 h后采用Western blotting技术检测LAT1过表达后乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达变化。荧光显微镜检测结果显示,LAT1真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞;Western blotting检测结果显示,LAT1过表达的奶牛乳腺上皮细胞中LAT1极显著增加（P<0.01）,β-酪蛋白的表达显著升高（P<0.05）,4F2hc表达变化不显著（P>0.05）。这些结果提示LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用。     

奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导

本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好.     

β-羟丁酸浓度对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达量的影响

本试验研究了不同浓度的β-羟丁酸(BHBA)对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)内乳蛋白合成相关基因表达量的影响。将传至第3代的BMEC以适宜的密度培养48 h后,随机分为6组,每组6个重复,每个重复1个培养孔。各组分别采用BHBA浓度为0(对照组)、0.58、1.16、2.32、4.64和9.28 mmol/L的培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48 h。收集细胞,采用SYBR Green实时荧光定量PCR法测定乳蛋白合成相关基因的表达量。结果表明:随着BHBA浓度的增加,αs1-酪蛋白(CSN1S1)基因表达量呈显著的一元二次曲线增加(R2=0.931 6,P=0.018),其中以2.32~9.28 mmol/L组较高,尤以4.64 mmol/L BHBA组最高。随着BHBA浓度的增加,瘦素(leptin)基因表达量呈一定的一次线性降低趋势(R2=0.482 5,P=0.126),从数值上看,以0.58 mmol/L BHBA组最高。信号转导和转录激活因子5(STAT5)和哺乳动物雷帕霉素靶点(m TOR)基因表达量与BHBA浓度间的回归关系不显著(P=0.459,P=0.398)。综合以上指标,BHBA的浓度为2.32~9.28 mmol/L可上调CSN1S1基因的表达,尤以BHBA浓度为4.64 mmol/L时对BMEC内乳蛋白合成的促进效果最好。     

脂肪酸对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂合成相关基因表达量的影响

本试验旨在探寻促进奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳蛋白和乳脂合成的短链脂肪酸(乙酸、β-羟丁酸)和长链脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸)的组合添加模式,为调控乳成分合成提供理论依据。BMECs经分离、纯化后,选取第2代细胞,分为5组,对照组不添加脂肪酸,Ⅰ组和Ⅱ组添加的乙酸、β-羟丁酸浓度比例均为2.0(9.60 mmol/L)∶1.0(4.80 mmol/L),油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例分别为2.0(17.30μmol/L)∶13.3(115.05μmol/L)∶1.0(8.65μmol/L)和9.6(75.20μmol/L)∶7.4(58.00μmol/L)∶1.0(7.80μmol/L);Ⅲ组和Ⅳ组添加的乙酸、β-羟丁酸的浓度比例均为1.0(7.20 mmol/L)∶1.0(7.20 mmol/L),油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例分别为2.0∶13.3∶1.0和9.6∶7.4∶1.0,各组添加的短链脂肪酸(SCFA)和长链脂肪酸(LCFA)总浓度为14.541 mmol/L,每组3个重复。培养24 h后,检测细胞相对增殖率(RGR)、甘油三酯(TAG)的合成量以及乳蛋白和乳脂合成相关基因的表达量。结果表明:1)试验组BMECs RGR及TAG的合成量均显著高于对照组(P0.05);Ⅰ组RGR最高,TAG合成量最多。2)与对照组相比,Ⅱ组显著提高了核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、κ-酪蛋白(CSN3)基因的表达量(P0.05);Ⅳ组显著提高了CSN3、蛋白激酶B(AKT)、S6K1、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因的表达量(P0.05);试验组信号转导和转录激活因子5(STAT5)基因的表达量显著降低(P0.05)。3)与对照组相比,试验组二酰甘油酰基转移酶2(DG AT2)基因的表达量显著提高(P0.05),脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达量显著降低(P0.05)。综上所述,在培养液中添加7.20 mmol/L乙酸、7.20 mmol/Lβ-羟丁酸、75.20μmol/L油酸、58.00μmol/L亚油酸、7.80μmol/L亚麻酸对BM ECs乳蛋白和乳脂合成相关基因的表达量有较好的促进作用。     

奶牛乳腺上皮细胞的克隆与特性分析

用组织块接种法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,进行形态学观察、生长曲线的绘制和核型分析等生物学性状的检测,并进行酪蛋白基因的RT-PCR鉴定。结果显示,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征;染色体数目为60;能够正常表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性酪蛋白基因,即as1-酪蛋白基因和β-酪蛋白基因。表明成功获得了奶牛乳腺上皮细胞克隆。     

奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及蛋白含量测定

为建立稳定的奶牛乳腺上皮细胞系(BMEC),进一步研究乳腺上皮细胞体外蛋白的分泌情况,本试验首先采用组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,用胰蛋白酶纯化细胞,并运用SDS-PAGE进行鉴定。采用MTT分析细胞活力,瑞氏-吉姆萨染色法对细胞核进行分析,并测定细胞上清液中β-酪蛋白(β-CN)含量。结果显示:本试验成功培养出较纯化的奶牛乳腺上皮细胞;细胞生长曲线呈明显"S"型,用瑞氏-吉姆萨法染色细胞,细胞核形态多为卵圆形且呈现明显蓝紫色。原代乳腺上皮细胞可连续多次传代且未出现永生化,细胞呈单层贴壁生长,证明细胞活力良好;测定其β-CN含量为3.3 mg/L。     

IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白表达的影响

为了研究外源添加不同浓度的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂和乳蛋白含量的影响,试验选取生长状态良好的第三代乳腺上皮细胞进行培养,试验组添加浓度分别为25,50,75μg/m L的IGF-Ⅰ,对照组仅添加与试验组等体积的完全培养基,用高效液相色谱法检测乳用三酰甘油的表达量,用Western-blot法测定培养12,24,48,72小时时的细胞乳蛋白中α-酪蛋白和κ-酪蛋白的表达量。结果表明:添加25μg/m L IGF-Ⅰ的试验Ⅰ组,细胞乳脂表达极显著高于对照组及其他试验组(P0. 01);试验组乳蛋白的表达均显著或极显著高于对照组(P0. 05或P0. 01)。说明IGF-Ⅰ对BMECs乳脂和乳蛋白的表达具有一定促进作用。     

糖原合成酶激酶3β对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响

本试验通过向纯化的奶牛乳腺上皮细胞中添加不同浓度（0（对照组）、10、20、40 mmol/L）的糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK3β）特异性蛋白抑制剂氯化锂（Licl）,作用细胞24 h,研究其对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响,并利用qRT-PCR和Western blotting分别检测不同浓度Licl对奶牛乳腺上皮细胞中GSK3β、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1） mRNA水平及GSK3β、磷酸化GSK3β （p-GSK3β）、Cyclin D1蛋白水平表达的影响。结果显示,Licl能促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖活性,Licl抑制GSK3β后促进奶牛乳腺上皮细胞增殖的最佳浓度为20 mmol/L。与对照组相比,添加Licl后GSK3β蛋白表达受到抑制,p-GSK3β蛋白表达上调,同时提高了Cyclin D1蛋白表达。表明GSK3β对于奶牛乳腺上皮细胞增殖的能力是负调控因子,失活的GSK3β通过Cyclin D1途径促进细胞周期的进行。     

苜蓿素对脂多糖诱导下奶牛乳腺上皮细胞炎症和乳蛋白合成相关基因表达的影响

为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P0.05),而T组则显著升高(P0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P0.01),而一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量则显著低于L组(P0.01)。3)LPS能够显著升高细胞的白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、Toll样受体2(TLR2)、TLR4和髓样分化因子88(My D88)表达水平(P0.01),而添加苜蓿素能够显著降低IL-1β、TNF-α、TLR2和TLR4的表达水平(P0.01)。4)与对照组相比,T组细胞的酪氨酸激酶2(JAK2)、信号转导子和转录激活子5(STAT5)、雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4EBP1)和核糖体S6蛋白激酶1(S6K1)表达量显著升高(P0.01),而碱性氨基酸转运载体1(CAT1)表达量显著降低(P0.01)。LPS能够显著降低细胞的CAT1、L型氨基酸转运载体1(LAT1)、STAT5、m TOR和4EBP1表达水平(P0.01或P0.05),而添加苜蓿素能够显著升高STAT5表达水平(P0.01)。结果表明,乳腺细胞在LPS刺激下,导致细胞内炎症因子基因表达升高和抑制乳蛋白合成相关基因的表达,而添加苜蓿素能够抑制乳腺细胞内炎症因子基因表达,但对乳蛋白合成的相关基因表达作用不明显;无LPS刺激下,添加苜蓿素能够提高乳腺细胞活性和促进乳蛋白合成相关基因的表达。