沙地葡萄茎痘相关病毒的RT-LAMP检测方法

 本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus, GRSPaV）的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列（GenBank登录号：GQ478314）为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并确定了适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行Hha Ⅰ酶切,酶切片段与理论片段大小一致,证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10^-4,与RT-PCR方法相比更为灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ （×1000）可直接观察反应结果。建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法.同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断.特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致.     

南方水稻黑条矮缩病毒检测方法的比较

为明确南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）检测方法的最佳适用范围,对其现有检测方法Real time RT-PCR、RT-LAMP、RT-PCR的灵敏性及特异性进行了比较,并分析了依据SRBSDV单克隆抗体3F1建立的斑点免疫结合印迹（dot immunobinding assay, DIBA）方法对检测植物寄主和白背飞虱Sogatella furcifera Horvth的特异性。结果表明,灵敏性以Real time RT-PCR方法最高,其次为RT-LAMP方法,而普通RT-PCR方法相对较低。这3种方法均可特异性检测SRBSDV植物寄主和白背飞虱;DIBA方法可以满足SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV）植物寄主和白背飞虱大量样品的检测,但不能区分SRBSDV和RBSDV。Real time RT-PCR方法实现了短时间内对SRBSDV RNA拷贝数的相对定量;RT-LAMP方法全程恒温反应,无需热循环仪。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒

 根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。     

环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒

小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV,与其他4种病毒(菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus)不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

应用巢式RT-PCR检测水仙退化病毒1

水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus,NDV）是水仙上发生较为严重的病毒之一。本文根据 NDV 已报道的外壳蛋白基因序列,设计特异性引物,以感病水仙的总 RNA 为模板,建立了快速检测 NDV 的巢式 RT-PCR 方法。结果表明,巢式 RT-PCR 具有良好的特异性和灵敏度,能够从感染 NDV 的水仙样品上扩增出与预期大小相符的特异性目的条带,同时与其他病毒无交叉反应;灵敏度测定结果表示,巢式 RT-PCR 灵敏度较高,是普通 RT-PCR 的104倍,当 RNA 稀释到109倍时仍能被检测到。本文建立的巢式 RT-PCR 为水仙上 NDV 的快速检测提供了技术参考依据。     

大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白（coat protein, CP）基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。     

RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国对外公布的检疫性有害生物,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一种快速、灵敏和特异的BPMV检测方法。根据BPMV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对BPMV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高1 000倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中60℃等温扩增,整个检测周期约2~2.5 h,适合BPMV的快速、准确检测。     

山东葡萄产区主要病毒病发生危害调查

采用DAS- ELISA检测方法 ,对山东省葡萄主产区的葡萄病毒病害进行了调查 ,明确危害当地葡萄主要是葡萄扇叶病毒 (grapevine fanleaf virus ,GFLV)和葡萄卷叶病毒 (grapevine leafroll associated virus,GLRaV)。病毒感染率为 59.1% ,其中鲜食品种病毒感染率为57% ,酿酒品种的感染率为 62.5%。苗木与成龄树感染GFLV的比率分别为 78.4%和56% ,感染GLRaV的比率分别为55.3%和70%。病毒感染率较高的品种有霞多丽、梅露汁和佳丽酿。病毒病的发生与品种、栽培年限、繁殖方式和苗木来源有关 ,其中带毒苗木是葡萄病毒病传播的关键因素     

齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。     

逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究

 本研究采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、简便的烟草环斑病毒检测方法。根据TRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的梯度条带。特异性试验表明,引物对TRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比普通RT-PCR高10倍。通过反应温度和时间的优化,该方法只需在水浴锅中60℃等温扩增60 min,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国对外公布的检疫性有害生物。本研究根据该病毒外壳蛋白基因的保守序列,设计得到特异性引物及Taqman荧光探针,建立了MCMV的实时荧光RT-PCR方法,并对其灵敏度与特异性进行了研究。该方法针对2个不同来源的毒株均能得到典型扩增曲线,而没有从小麦线条花叶病毒、玉米粗缩病毒和玉米矮花叶病毒的RNA得到扩增曲线,表明引物与荧光探针具有良好的特异性。针对玉米褪绿斑驳病毒RNA不同稀释度样品,实时荧光RT-PCR检测低限达到10-5稀释度,检测灵敏度要比普通RT-PCR高出100倍。因此,本研究建立的MCMV实时荧光方法具有特异性强、灵敏度高和快速有效的优点。     

葡萄茎尖组培苗中扇叶病毒的酶联（ELISA）检测

目前使用的扇叶病毒(GFLV)检测方法包括:接种昆诺藜与千日红、嫁接接种砂地葡萄(Vitis rupestris Scheele)的St.George 品种、免疫双扩散,抗体致敏乳胶试验、免疫电镜及酶联免疫吸附试验(ELISA)。(ELISA)方法由于无需特殊设备,从而得到最广泛应用。在植株体内,GFLV 的含量随季节而变化。在某些时期,含量很低,即使用ELISA,也无法测出其中的 GFLV。茎尖     

逆转录环介导等温扩增技术检测草莓潜隐环斑病毒的研究

采用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,建立了草莓潜隐环斑病毒（Strawberry latent ringspot virus, SLRSV）检测方法。根据SLRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过逆转录环介导等温扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对SLRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP的灵敏度比普通RT-PCR高出100倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中65 ℃等温扩增,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

实时荧光RT-PCR方法检测香石竹环斑病毒

 本研究以香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus, CRSV)的5个分离物为研究对象,根据CRSV运动蛋白（MP）基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了检测CRSV 的实时荧光RT-PCR（real-time fluorescent RT-PCR）方法。该方法利用TaqMan探针水解产生的荧光信号实时监测目标基因的扩增,实现real-time fluorescent PCR扩增和检测同步进行。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法具有更快速、灵敏和特异的优点,与普通RT-PCR方法相比其灵敏度提高了100倍,适合于对进境种苗携带的CRSV的快速检测。     

葡萄卷叶伴随病毒4和5简并引物和多重PCR检测

研究建立了葡萄卷叶伴随病毒4和5(Grapevine leafroll associated virus 4and 5,GLRaV-4and 5)的简并引物及多重PCR检测方法。比较了单一PCR、多重PCR和简并引物检测方法的灵敏度,并对简并引物的特异性进行了分析。结果表明,采用简并引物和多重PCR对这两种病毒进行检测,其灵敏度与单一PCR相同,且简并引物仅对葡萄卷叶伴随病毒4和5具有特异性。本研究建立的方法能够同时、快速、灵敏地检测上述2种葡萄卷叶病毒,提高了检测效率,降低了检测费用。     

基于TaqMan MGB探针的花生矮化病毒检测研究

花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)是我国进境检疫性有害生物。本研究根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了PSV的实时荧光RT-PCR检测方法。方法特异性研究表明,针对PSV的2个不同株系PSV-E和PSV-W,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为20.10和21.22;而对于黄瓜花叶病毒、番茄不孕病毒、马铃薯Y病毒、菜豆荚斑驳病毒以及烟草环斑病毒等其他毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高100倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对PSV的检测。