一种豇豆重花叶病毒RT-PCR检测方法的研究

对一种豇豆重花叶病毒(Cowpeas evere mosaic virus,CPSMV)反转录PCR分子检测方法进行了研究。利用从美国菌种保藏中心和德国微生物毒株保藏中心引进的CPSMV标准毒株,设计了一对特异性简并引物(CPSMVf/CPSMVr),建立了CPSMVRT-PCR检测方法。该方法具有良好的扩增反应及特异性,灵敏度可达1pg的总病叶组织RNA量。CPSMV双抗夹心酶联免疫法(DAS-ELISA)灵敏度为10μg叶组织。该方法适用于豇豆等豆类蔬菜种子及种苗中对豇豆重花叶病毒的快速检测。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒

 根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法.同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断.特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致.     

RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国对外公布的检疫性有害生物,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一种快速、灵敏和特异的BPMV检测方法。根据BPMV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对BPMV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高1 000倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中60℃等温扩增,整个检测周期约2~2.5 h,适合BPMV的快速、准确检测。     

环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒

小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV,与其他4种病毒(菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus)不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

基于免核酸提取可视化RT-LAMP快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列，筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法 (加SYTO-9)和可视化方法 (加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明，优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×10³ fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析，表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0 (1～1, 95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择，对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。     

逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究

 本研究采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、简便的烟草环斑病毒检测方法。根据TRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的梯度条带。特异性试验表明,引物对TRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比普通RT-PCR高10倍。通过反应温度和时间的优化,该方法只需在水浴锅中60℃等温扩增60 min,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

逆转录环介导等温扩增技术检测花生条纹病毒

花生条纹病毒病(Peanut stripe virus,PStV)是我国花生上流行最广[1]、田间发病率最高的一种花生病毒病,严重影响花生的产量和品质.由于PStV存在不同症状类型株系,在中国占优势的轻斑驳株系,引起花生症状较轻,并且与其他花生病毒病症状类似,不易分辨,目前主要利用PCR方法对PStV进行检测[2],但该方法检测时间长,并且需要专业仪器,较难普及.     

南方水稻黑条矮缩病毒检测方法的比较

为明确南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）检测方法的最佳适用范围,对其现有检测方法Real time RT-PCR、RT-LAMP、RT-PCR的灵敏性及特异性进行了比较,并分析了依据SRBSDV单克隆抗体3F1建立的斑点免疫结合印迹（dot immunobinding assay, DIBA）方法对检测植物寄主和白背飞虱Sogatella furcifera Horvth的特异性。结果表明,灵敏性以Real time RT-PCR方法最高,其次为RT-LAMP方法,而普通RT-PCR方法相对较低。这3种方法均可特异性检测SRBSDV植物寄主和白背飞虱;DIBA方法可以满足SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV）植物寄主和白背飞虱大量样品的检测,但不能区分SRBSDV和RBSDV。Real time RT-PCR方法实现了短时间内对SRBSDV RNA拷贝数的相对定量;RT-LAMP方法全程恒温反应,无需热循环仪。     

沙地葡萄茎痘相关病毒的RT-LAMP检测方法

 本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus, GRSPaV）的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列（GenBank登录号：GQ478314）为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并确定了适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行Hha Ⅰ酶切,酶切片段与理论片段大小一致,证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10^-4,与RT-PCR方法相比更为灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ （×1000）可直接观察反应结果。建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。     

应用TaqMan MGB探针技术检测菜豆荚斑驳病毒

根据菜豆荚宽驳病毒(Beanpod mottle virus,BPMV)不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了BPMV的实时荧光RT-PCR检测方法.该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高了100倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适于对BPMV的快速检测.应用该方法,对来自美国不同地区的携带有BPMV的大豆样品进行检测,均能够得到BPMV的典型扩增曲线,表明引物与探针对BPMV不同分离株具有良好的简并性.