奶牛乳房炎病原菌多重PCR检测方法的建立

为了同时检测奶牛乳房炎多种病原菌,试验采用金黄色葡萄球菌(S.aureus)nuc基因、牛支原体(M.bovis)oppD/F基因、大肠杆菌(E.coli)16S-23S rRNA基因内转录间隔区作为靶标设计3对特异性引物,在优化单菌退火温度的基础上确定多重PCR的退火温度,建立S.aureus、M.bovis和E.coli的多重PCR检测方法,验证多重PCR的重复性、特异性、敏感性及实用性。结果表明:基于单一PCR三者共同的最佳退火温度(55.3℃、56.5℃、57.8℃)优化多重PCR退火温度,最终确定57.8℃为三者最佳的退火温度。该方法能扩增出长度为237 bp(S.aureus)、333 bp(M.bovis)、634 bp(E.coli)的基因片段;靶标菌特异性扩增而非靶标菌无扩增条带,最低检测浓度分别为S.aureus 1 pg/μL、M.bovis 1 pg/μL、E.coli 100 fg/μL;正常乳样和临床乳房炎乳样均检出S.aureus(25.9%、53.8%)、M.bovis(10.3%、17.9%)和E.coli(32.8%、71.8%),但乳房炎乳样的阳性检出率高于正常乳样。说明本研究建立的多重PCR方法特异性和敏感性强、稳定性和实用性高,具有良好的推广应用前景。     

奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

奶牛子宫内膜炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测奶牛子宫内膜炎常见致病菌的方法,根据致病性大肠杆菌的ycjM基因、化脓隐秘杆菌的plo基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因、乳房链球菌的pauA基因、绿脓杆菌的O抗原乙酰基转移酶基因和奇异变形杆菌的尿素酶合成的正向调节因子R基因设计特异性引物,建立奶牛子宫内膜炎常见致病菌多重PCR检测方法。结果表明,该多重PCR检测方法反应特异性良好,其最佳退火温度为58℃,循环次数30次,各目标菌模板敏感度终质量浓度在4～40μg/L。对11份临床采集样品进行检测,其检测结果与传统鉴定结果一致。本试验建立的多重PCR检测方法,可同时检测6种奶牛子宫内膜炎常见致病菌,为该病的快速检测诊断提供技术支持。     

马腺疫链球菌fneB基因LAMP检测方法的建立及应用

为了建立快速简便的fneB-LAMP检测法用于马腺疫病原马链球菌马亚种(S.equi)的检测,本试验采用恒温水浴进行LAMP扩增,建立可视化fneB-LAMP检测方法.结果显示:对大肠埃希菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球、蜡状芽孢杆菌和克雷伯杆菌5种菌与标准S.equi菌株检测,只能够检测出标准阳性菌株;对新疆昭苏县3个马...     

阿里红活性部位提取物体外抑制奶牛乳房炎致病菌研究

为研究阿里红各活性部位对奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性。提取阿里红多糖、多酚、黄酮、生物碱及挥发油,并对各有效部位成分进行了含量测定。通过体外抑菌试验,检测各有效部位对奶牛乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)及链球菌(Streptococcus)的抑菌作用。结果表明,阿里红黄酮和生物碱对3种致病菌均具有一定的抑菌作用,且对金黄色葡萄球菌和链球菌的抑菌作用最强,可以作为抗金黄色葡萄球菌和链球菌进一步研究的材料。     

奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man荧光PCR检测方法的建立

为同时检测大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌,提高对奶牛乳房炎的诊断率,本试验针对3种病原菌的保守序列设计合成了3套特异性引物,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法。结果显示,该检测方法具有高特异性,与肠炎沙门菌、肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌等无交叉反应;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的最低检测浓度分别为10~(3 )、10~2和10~(4 )拷贝数/μL,敏感度较高。DNA各个拷贝数浓度的变异系数均低于2.02%,表明重复性良好。对24份临床采集奶样的检测结果表明,建立的多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法可用于临床大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测,具有良好的推广应用价值。     

浙江省主要奶牛养殖区奶牛隐性乳房炎病原菌调查

对浙江省四个主要奶牛养殖区金华、杭州、宁波以及台州的30个奶牛场中846头泌乳牛的3178个乳区进行了奶牛隐性乳房炎病原菌调查.首先用HMT乳房炎诊断试剂检查乳区奶样,采集HMT反应为阳性(++)和强阳性(+++)的乳区奶样进行细菌分离鉴定,对分离到的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)进行药敏试验.结果表明,浙江省奶牛隐性乳房炎的头阳性率为54.3%,乳区阳性率为28.0%.主要病原菌的检出率依次为凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negative staphylococci)34.0%、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)27.0%、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)12.2%、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)13.0%、乳房链球菌(Streptococcus uberis)6.2%等.药敏试验结果表明,对青霉素、氨苄青霉素敏感的金黄色葡萄球菌分离株只有20.3%,对四环素和红霉素的敏感率也较低(34.8%和47.8%).多重耐药现象比较普遍,主要是对青霉素、氨苄青霉素、四环素、红霉素同时耐药.     

荧光定量PCR检测牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立

为建立检测牛乳中金黄色葡萄球菌(S.aureus)肠毒素A基因(SEA)定性定量的检测方法,本研究针对S.aureus SEA基因片段设计1对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-time PCR检测方法.结果显示,特异性产物Tm值为78.2℃～78.5℃,最低可检测到49.5 fg/μL(16.5拷贝)的阳性质粒.标准曲线的相关系数为0.99.与其他常见的产SEB的S.aureus、产SEC的S.aureus、无乳链球菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌DH5 α及JM109均无交叉反应.该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为牛乳中S.aureus的快速检测提供了新的技术手段.     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

河北省奶牛乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立

为同时检测奶牛源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌,本试验根据GenBank中3种病原菌的nuc、ef-tu和eta基因保守序列分别合成了3对特异性引物,通过对反应条件、反应体系优化,建立了多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法与大肠杆菌、克雷伯杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌无交叉反应,敏感性试验结果表明,多重PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌的检出限为10~(-3) mg/L。应用该方法对150份临床样品进行检测,结果金黄色葡萄球菌与无乳链球菌混合感染检出率为28.7%(43/150),金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为14%(21/150),无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为11.3%(17/150),3种菌混合感染检出率为6%(9/150)。应用多重PCR检测结果与分离培养诊断方法结果进行比较,均能检测出样品中的病原菌,2种检测方法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌92.6%,无乳链球菌91.3%,绿脓杆菌94.6%。该检测方法对奶牛乳房炎的防控、临床监测及疾病诊治具有重要意义。     

大连地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验

为了明确引起大连地区奶牛隐性乳房炎的主要病原菌及其发病情况,对大连市不同地区的256头黑白花泌乳奶牛进行调查研究,对奶牛隐性乳房炎奶样进行病原菌的分离鉴定及药敏试验。结果表明,检出奶牛隐性乳房炎阳性率为65.63%、乳区阳性率为51.95%;病原菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌(Streptococcus)和大肠杆菌(Escherichia coli)为主,占检出细菌总数的83.33%;体外药敏试验筛选出了对主要病原菌高度敏感的药物,能有效地治疗奶牛隐性乳房炎。     

多重PCR与细菌培养法检测牛乳中病原菌的对比研究

为了验证所建立的多重PCR法检测奶牛乳腺炎的灵敏性,应用所建立的多重PCR法与传统细菌培养法对临床型乳腺炎(54份)和隐性乳腺炎(145份)共计199份乳样进行了无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测,检测结果用SPSS 18.0软件进行统计分析。结果表明:对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测,多重PCR法的灵敏性显著高于细菌培养法(P0.05),而对无乳链球菌的检测,两种方法的敏感性无显著差异(P0.05)。说明所建立的多重PCR法灵敏性高于细菌培养法。     

罗非鱼链球菌双重荧光PCR方法的建立及临床应用

为构建一种无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)的双重荧光PCR检测方法,根据筛选的海豚链球菌LysR基因和无乳链球菌Sip基因设计特异性引物和探针,优化反应浓度和退火温度,建立标准曲线,分析方法的敏感性、特异性和重复性,最后进行方法的初步应用。结果显示：当无乳链球菌引物和探针浓度分别为0.20和0.16μmol/L,海豚链球菌引物和探针浓度分别为0.20和0.32μmol/L,且退火温度为53℃时,建立的双重荧光PCR方法荧光曲线标准,线性关系线良好,有较高的扩增反应效率;无乳链球菌和海豚链球菌最低检测限分别为29.6和10.7 CFU/mL,与猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)和其他8种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应,重复变异系数均小于2%;临床样品及人工污染样品检测结果与细菌分离鉴定方法符合率为100%。结果表明,本研究建立的罗非鱼链球菌双重荧光PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时对无乳链球菌和海豚链球菌进行检测,为罗非鱼链球菌病的临床诊断和研究...     

马链球菌马亚种8组分融合蛋白的表达及小鼠免疫效果的评价

马腺疫是由马链球菌马亚种(S. equi)引起的急性接触性马属动物传染病，严重影响幼驹的生长发育。我国尚无预防该病的有效疫苗，也缺乏S. equi动物感染和免疫保护模型。为在原核系统中表达马链球菌马亚种(S. equi)的多组分融合蛋白，并评价其对小鼠的免疫保护效果，本研究以S. equi HLJ2018株DNA为模板，分别经PCR扩增其cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE基因，并分别克隆至pGEX-6p-1载体中，构建表达这8个蛋白的重组质粒并分别经PCR和测序鉴定。通过在各基因之间引入蛋白接头Gly-Gly-Gly编码基因序列并利用同源重组技术依次串联该8个基因，得到融合基因se8，利用其构建重组质粒pET-28a-SE8 (His标签)及pGEX-6p-1-SE8(GST标签)，均经PCR和测序鉴定后，将这两个表达SE8及分别表达该8个蛋白的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后采用亲和柱层析法纯化，采用SDS-PAGE检测各蛋白的表达及纯化效果；采用western blot检测各蛋白的反应原性。SDS-PAGE结果显示...     

奶牛乳腺炎病原菌的分离、耐药性分析及其特异性卵黄抗体的体外抑菌效果

试验从新疆石河子地区3个建设兵团采集60份临床型乳腺炎患牛的奶样。细菌分离纯化后,在VITEK 2微生物自动分析系统基础上,利用16S r DNA序列分析对乳腺炎主要致病菌进行菌种鉴定,并对病原菌进行药敏试验。结果表明,60份奶样中共分离14种细菌,其中无乳链球菌(S.agalactiae)最多(20%),其次为金黄色葡萄球菌(S.aureus)(15.56%)。选择14种常用抗生素,采用Kithy-Bauer纸片法,对分离出的病原菌进行药敏试验,无乳链球菌和金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性最强(耐药菌株最多)。通过免疫蛋鸡制备无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的特异性卵黄抗体(Ig Y),体外抑菌试验表明,10mg/m L的特异性Ig Y能够有效抑制两种细菌的生长,为卵黄抗体替代抗生素防治奶牛乳腺炎提供一定理论基础。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌和大肠杆菌二重PCR检测方法的建立

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。选取金黄色葡萄球菌的Nuc基因和大肠杆菌16S-23SrRNA基因作为扩增靶基因序列,设计两对特异性引物。通过正交试验优化反应条件建立二重PCR检测体系,优化结果表明二重PCR扩增出两条特异性条带,大小与实验设计的249bp(金黄色葡萄球菌)和375bp(大肠杆菌)相符,而对其它奶牛乳房炎主要病原菌的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出14.6pg的金黄色葡萄球菌模板和26.0pg的大肠杆菌模板。使用该二重PCR检测29份临床奶样,发现其中17份携带相关基因,并分离得到相关致病菌。     

水禽4种常见致病菌多重PCR方法的建立及应用

为建立一种能同时检测大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,试验根据大肠杆菌phoA基因、鸭疫里默氏杆菌ompA基因、多杀性巴氏杆菌kmt 1基因、金黄色葡萄球菌FemB基因的保守区域设计4对特异性引物,通过优化退火温度和引物浓度建立多重PCR方法,检验该方法的特异性、敏感性性、重复性,应用该方法检测145份病死水禽临床样品,并与传统细菌分离鉴定方法进行比较。结果表明：优化后的最佳退火温度为52℃,引物浓度为10μmol/L。建立的多重PCR方法能特异性地扩增出靶基因,沙门氏菌、链球菌、产气荚膜梭菌等临床常见菌均未扩增出条带,对大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种细菌的检出下限是0.4 pg/mL,单一PCR扩增ompA、kmt 1、phoA和FemB基因的检出下限分别为4×10^-3,0.4,4×10^-3,4×10^-6 pg/mL。多重PCR方法对临床样品的检测结果与传统细菌分离鉴定方法的符合率均在90%以上。说明试验建立的多重PCR方法具有结果稳定、重复性高的特...     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

猪链球菌病的诊断与防控

一、病原 能引起猪链球菌病的病原复杂,主要有马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp equi)、猪链球菌(Streptococcus suis)、马链球菌类马亚种(Streptococcus equisubsp equi similis)以及兰氏分群中D、E、L群的链球菌等.尽管在临床上也常常能分离到其它的链球菌,但我国流行的主要病原为马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型.     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。