妇科千金片对盆腔炎大鼠TLR2/4-NF-κB信号通路影响的研究

目的 观察妇科千金片对盆腔炎大鼠子宫Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）、核转录因子kappaB（NF-κB）mRNA表达的影响,探讨妇科千金片调控TLR2/4-NF-κB信号通路对盆腔炎大鼠的抗炎机制。方法 通过子宫注射混合菌液建立盆腔炎大鼠模型,将60只雌性SD大鼠随机分为5组,每组12只,即：空白组、假手术组、模型组、妇科千金片组、罗红霉素组,分别予以相应药物干预,运用免疫组化检测子宫组织中TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值;运用实时荧光定量PCR检测子宫组织中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA表达变化。结果 与空白组、假手术组比较,模型组的TLR2、TLR4、NF-κB灰度值显著降低（P<0.01）,TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表达均显著升高（P<0.01）,表明模型成功;与模型组比较,妇科千金片组、罗红霉素组TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均显著升高（P<0.01）,TLR2、TLR4、NF-κBmRNA均显著降低（P<0.01）。结论 妇科千金片对盆腔炎大鼠抗炎的作用机制,可能是通过调控TLR2/4-NF-κB炎性介质变化信号通路的传导而实现的。     

PCV2感染对仔猪肝脏MyD88-NF-κB信号途径的影响

选取31头经检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性的5周龄断奶仔猪,随机分为对照组16头和试验组15头,对照组仔猪每头滴鼻4 mL PBS,试验组仔猪每头滴鼻4 mL 5×105TCID50.mL-1PCV2悬液。于PCV2接种当天剖杀4头仔猪作为对照组,分别于14、21和35 d剖杀4头对照组和5头试验组仔猪,采集肝脏。用激光共聚焦显微镜检测核因子κB/P65(NF-κB/P65)蛋白的核易位变化;蛋白提取法分别提取肝脏细胞核蛋白和胞浆蛋白,Western blot定量检测细胞核中NF-κB/P65和细胞浆中p-IκBα、MyD88蛋白含量的变化;电泳迁移率(EMSA)法检测细胞核中NF-κB DNA的结合率变化。检测结果显示,PCV2接种仔猪,肝脏中NF-κB/P65蛋白核易位逐渐增多,到21 d达到峰值;p-IκBα、MyD88、NF-κB/P65 DNA结合率在接种后均先升高后趋于恢复,并于21 d达到高峰。与对照组仔猪相比,肝脏中MyD88和NF-κB/P65蛋白含量以及NF-κB DNA结合率在14和21 d试验组均显著升高(P<0.05),35 d含量变化不显著;21 d时试验组p-IκBα蛋白含量显著升高。相关性分析显示,NF-κB/P65蛋白含量与MyD88含量、NF-κB DNA结合率之间存在显著正相关,相关系数分别是0.566和0.528。结果表明,PCV2可通过激活MyD88启动NF-κB信号途径;通过IκBα的磷酸化降解激活NF-κB,并促进其进行核易位,使NF-κB与DNA发生结合,调控相关炎性细胞因子的转录和表达。     

氟苯尼考对肉鸡空肠黏膜的完整性及免疫相关基因表达的影响

研究空肠免疫相关指标及绒毛结构的变化在氟苯尼考致肉鸡腹泻中的作用。40羽1日龄肉鸡适应性饲养7 d后,随机分为对照组、氟苯尼考组（饮水添加100 mg·(kg?d)^-1氟苯尼考至35日龄）,35日龄检测体重、脾脏与胸腺指数,取空肠组织以HE染色,观察组织切片并测量绒毛长度、隐窝深度且计算绒隐比,荧光定量PCR检测空肠TLR4、MyD88、NF-κB和TNF-α基因表达量。结果表明,与对照组相比,氟苯尼考组肉鸡空肠绒毛长度、绒隐比极显著下降（P＜0.01）,隐窝深度极显著升高（P＜0.01）;体重、脾脏指数与胸腺指数极显著下降（P＜0.01）;TLR4、MyD88、NF-κB与TNF-α mRNA相对表达量极显著升高（P＜0.01）。空肠绒毛结构功能改变及免疫相关指标异常表达参与了氟苯尼考致肉鸡腹泻的发生发展。     

泛素基因沉默对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响

为了探讨泛素(ubiquitin,简称Ub)对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响,通过脂质体将短发夹RNA(shRNA)质粒转染猪小肠上皮细胞,使其泛素基因沉默,于转染后6、12、24、48 h收集细胞及其上清。应用荧光定量PCR检测细胞内TLR4/NF-κB信号通路中关键分子TLR4、NF-κB、MyD88、IκB-α的mRNA表达水平,应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α、IL-1含量的变化。结果显示,shRNA质粒有效地抑制了泛素基因的表达,转染shRNA质粒后,TLR4/NF-κB信号通路中TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA表达量及NF-κB、IκB-α、TNF-α和IL-1含量均普遍呈下降的趋势,说明泛素在炎性因子的释放中起着至关重要的作用,泛素基因的沉默能够抑制该通路的活化。     

益气养阴清热方对KKAy小鼠GLP-2、IFN-γ、NF-κB的影响

目的 探讨益气养阴清热方对自发性2型糖尿病（KKAy）小鼠胰高血糖素样肽2（glucagon-like peptide 2,GLP-2）、γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）、核因子κB（nuclear factor kappa beta,NF-κB）的影响。方法 取雄性SPF级KKAy小鼠50只,随机分为模型组,二甲双胍组,益气养阴清热方高、中、低剂量组,每组各10只;另取10只C57BL/6J小鼠作为正常组。各组予以相应干预。干预8周后检测各组小鼠GLP-2、IFN-γ、NF-κB水平。结果 与正常组比较,模型组小鼠IFN-γ、NF-κB明显升高（P<0.01）,GLP-2水平明显降低（P<0.01）。益气养阴清热方高、中、低剂量组均可降低KKAy小鼠IFN-γ水平（P<0.05）;益气养阴清热方高剂量组可降低小鼠NF-κB水平（P<0.05）;益气养阴清热方高、中、低剂量组均可升高小鼠GLP-2水平（P<0.05）。结论 益气养阴清热方能改善糖尿病小鼠血糖、胰岛素抵抗,其作用可能与提高GLP-2水平、降低炎症反应相关。     

β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞损伤的作用机制研究

【目的】研究β-伴大豆球蛋白通过核因子-κB(NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路对猪肠上皮细胞（IPEC-J2）造成损伤的差异,为探索β-伴大豆球蛋白引发仔猪肠道黏膜损伤的分子机制提供理论依据。【方法】采用β-伴大豆球蛋白体外诱导IPEC-J2损伤,试验设对照组T0（猪肠上皮细胞不做处理）,试验组T1（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白）、T2（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L NF-κB抑制剂二硫氨基甲酸肽吡咯烷（PDTC））、T3（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L iNOS抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME））、T4（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L JNK抑制剂SP600125）和T5（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L p38抑制剂SB202190）,处理24 h后观察细胞结构,测定各组细胞活性及细胞因子NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ含量,细胞损伤相关基因NF-κB p65、iNOS、JNK、p38及其编码蛋白的表达水平。【结果】在IPEC-J2中加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白24 h后,细胞数量减少,线粒体改变,染色质边集,细胞活性显著下降（P<0.05）,NO、TNF-α、IFN-γ含量均极显著增加（P<0.01）,而IL-10含量极显著减少（P<0.01）,NF-κB p65、iNOS、JNK和p38-mRNA表达水平极显著升高（P<0.01）,NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表达量极显著上升（P<0.01）;加入抑制剂后,细胞活性显著提高（P<0.05）,细胞结构趋于完整和规则,IL-10含量极显著增加（P<0.01）,而NO、TNF-α、IFN-γ含量极显著减少（P<0.01）,NF-κB p65、iNOS、JNK和p38-mRNA及其编码蛋白表达受到抑制。其中T2组细胞活性显著高于T3、T4、T5组（P<0.05）,细胞数量、形态和完整性最接近对照组细胞。【结论】β-伴大豆球蛋白主要通过NF-κB/iNOS信号通路对IPEC-J2造成损伤,PDTC对这种损伤作用的抑制效果最好。     

肝胃百合汤对慢性应激与幽门螺杆菌双重损伤因素模型小鼠胃黏膜组织HSP70、NF-κB蛋白表达的影响

目的 观察肝胃百合汤对慢性应激与Hp感染双因素损伤模型小鼠胃组织NF-κB、HSP70蛋白表达的影响,并研究其治疗机制。方法 将60只雄性小鼠随机分为6组,分别为空白组、单纯应激组、单纯Hp组、Hp+应激组、肝胃百合汤组及雷尼替丁组;空白组和单纯Hp组正常饲养,不限制进食进水;其余各组小鼠随机选取禁食、禁水、电击、行为束缚等10种刺激方法制备慢性应激小鼠模型。于造模第7天时,除空白组及单纯应激组外,其余各组小鼠给予Hp菌液灌胃;连续造模14 d时,肝胃百合汤组小鼠灌胃肝胃百合汤,雷尼替丁组小鼠予以灌胃盐酸雷尼替丁,其他各组小鼠灌胃蒸馏水;连续干预14 d后,取胃组织检测溃疡指数;采用免疫组化法检测小鼠胃黏膜组织HSP70、NF-κB的蛋白表达。结果 对比空白组,单纯Hp组、单纯应激组以及Hp+应激组小鼠的溃疡指数与HSP70、NF-κB蛋白表达明显升高（P<0.01）,且Hp+应激组小鼠的溃疡指数及NF-κB蛋白表达显著高于单纯应激组及单纯Hp组（P<0.01）;对比Hp+应激组,肝胃百合汤组和雷尼替丁组小鼠溃疡指数均显著降低（P<0.01）,且肝胃百合汤小鼠的溃疡指数组显著低于雷尼替丁组（P<0.01）;肝胃百合汤组和雷尼替丁组HSP70蛋白表达显著增加（P<0.01）,NF-κB蛋白表达显著降低（P<0.01）,且肝胃百合汤组HSP70蛋白表达量大于雷尼替丁组,NF-κB蛋白表达量低于雷尼替丁组（P<0.01）。结论 慢性应激与Hp可协同致胃黏膜损伤;肝胃百合汤可能是通过使HSP70蛋白表达增加,加强胃组织的自身修复作用,使受体的自身免疫能力提高,并降低NF-κB蛋白表达,减少其活性,使受损胃组织的炎症反应降低,从而起到抑制Hp,修复受损胃组织,加快胃溃疡好转的作用。     

基于SIRT1/NF-κB炎性通路探讨加味脑泰方对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马组织病理形态的影响

目的 探讨加味脑泰方（以下简称JWF）对血管性痴呆（vascular dementia,VD）大鼠SIRT1/NF-κB p56炎性通路的调控作用。方法 采用双侧颈总动脉结扎法（two-vessel occlusion,2-VO）复制VD大鼠模型。实验设正常组,假手术组,模型组,JWF高、中、低剂量组和奥拉西坦组,其中JWF高、中、低剂量组和奥拉西坦组分别灌胃给予JWF17.0、34.0、51.0 g/kg和奥拉西坦0.216 g/kg,其余3组灌服等容量蒸馏水,连续干预30 d。采用Morris水迷宫、HE染色分别检测大鼠学习记忆能力和海马组织病理形态变化;采用免疫组化检测沉默信息调节因子-1（silent informatio regulator-1,SIRT1）、核因子κB抑制蛋白d亚基（The nuclear factorκB inhibits theprotein subunit,IκBα）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）蛋白表达情况。结果 与正常组比较,模型组大鼠学习记忆能力显著降低（P<0.05）,海马神经元变性、坏死,炎性细胞浸润增加,且SIRT1、IκBα表达下调,NF-κB p56表达上调（P<0.05）;与模型组比较,奥拉西坦组和JWF高、中剂量组大鼠学习记忆能力显著增强（P<0.05）,海马组织中神经元锥体细胞排列较整齐,轮廓清晰,炎性细胞浸润显著减少,且海马组织内SIRT1、IκBα表达上调,NF-κB p56表达下调（P<0.05）。结论 JWF对血管性痴呆大鼠炎性相关信号通路SIRT1/NF-κB p56具有明显的调控作用,这可能是其保护VD大鼠海马神经元继而改善学习记忆能力的重要机制之一。     

Wip1正调控TLR4信号介导Ⅰ型干扰素的表达

Wip1是由基因ppm1d编码的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,不仅在细胞应激反应、增殖分化中起重要作用,还参与调控炎症反应和肿瘤发生等过程。Wip1能抑制TNF-α诱导的NF-κB激活,而NF-κB又是TLR4信号通路中的重要组分,因此推测Wip1在LPS诱导的TLR4信号通路中可能起调控作用。Western印记结果显示,在Wip1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs,Mouse embryonic fibroblasts）中,TLR4信号诱导的IRF3磷酸化程度显著降低。与此相一致,实时荧光定量PCR实验揭示,受LPS刺激后,Wip1 基因敲除的MEFs比野生型细胞产生更少的I型干扰素IFN-β和干扰素诱导基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）, 如Mx1, Mx2和Rasd2。将野生型和磷酸酶失活的Wip1分别回补进Wip1 缺失的MEFs,构建了野生型和突变体Wip1回补的细胞系进一步验证该结果。通过实时荧光定量PCR研究,发现野生型和磷酸酶失活的Wip1均能促进LPS诱导的ISGs的表达,Wip1不依赖于其磷酸酶活性来促进TLR4介导的I型干扰素反应。研究首次发现Wip1能通过增强IRF3的磷酸化来促进I型干扰素的表达,揭示了机体抵御病毒感染的新机制。     

PCV2通过激活NF-κB信号途径调节体外培养仔猪淋巴细胞IL-4和IL-12的分泌

选取8头猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗原、抗体阴性的普通断奶仔猪,无菌取其脾脏制成单细胞悬液后,随机分为4组:对照组、NF-κB抑制剂组(抑制剂组)、PCV2组和NF-κB抑制剂-PCV2组(抑制剂-PCV2组),体外培养24 h后收获淋巴细胞及培养上清液。ELISA方法检测培养上清液中IL-4和IL-12的含量;间接免疫荧光定位检测PCV2感染淋巴细胞的情况和核因子κB(NF-κB)蛋白入核情况,Western blot定量检测细胞浆中髓样分化因子88(MyD88)、磷酸化抑制性核因子кB(p-IкB)及NF-κB/p65和细胞核中NF-κB/p65蛋白含量的变化,电泳迁移率法(EMSA)检测细胞核中NF-κB与DNA的结合活性。结果显示,细胞培养上清液中,PCV2组IL-4含量明显低于对照组及抑制剂-PCV2组(P0.05),对照组与抑制剂-PCV2组无差异;PCV2组细胞培养上清液中IL-12含量显著高于对照组(P0.05),抑制剂-PCV2组极显著低于PCV2组(P0.01)。PCV2感染后可在淋巴细胞内观察到PCV2抗原,并主要存在于细胞浆中。淋巴细胞胞浆内MyD88蛋白含量,PCV2组极显著高于对照组(P0.01),PCV2组与抑制剂-PCV2组之间无显著差异。PCV2组淋巴细胞胞浆内p-IκBα的蛋白含量,胞核中NF-κB/p65含量及NF-κB与DNA结合活性均显著高于对照组;抑制剂和抑制剂-PCV2组淋巴细胞胞浆内p-IκBα的蛋白含量,胞核中NF-κB/p65含量及NF-κB与DNA结合活性均显著低于对照组。结论:PCV2可感染体外培养的仔猪淋巴细胞,介导MyD88-NF-κB信号途径激活从而调节淋巴细胞IL-4和IL-12的分泌。