水稻高效RNA干涉体系的建立及其在受体激酶基因功能研究中的应用

利用RNA干涉(RNAi)技术，可以特异性的抑制真核生物体中目标基因的表达。本研究构建了适合水稻转化的RNAi诱导载体pCADS1341。为检测其有效性，使用它构建了针对GUS基因的RNAi载体，并利用基因枪转化法导入GUS基因稳定表达的转基因水稻愈伤组织。GUS染色分析结果表明该载体中RNAi诱导元件的瞬时表达可显著抑制GUS基因的表达。为探讨影响水稻中转基因诱导的RNAi效率的因素，对针对某个目标水稻基因的水稻RNAi植株进行了详细的分析。通过Southern和Northern杂交检测了T0代RNAi植株中T-DNA插入的拷贝数和目标基因的表达量，筛选出T-DNA为单拷贝插入，且目标基因的表达被高效抑制的株系。对来源于该株系的T1代植株进行了半定量RT-PCR检测，结果表明RNAi效应可以遗传给后代转基因水稻植株，但是不同个体中的RNAi效率存在差异。RNAi系统的表达量可能是决定RNAi效率的最关键因素。我们建立的高效RNAi技术体系对于水稻功能基因组学研究具有重要意义，利用这个系统我们已经构建了60多个水稻受体激酶基因的RNAi载体，系统的研究正在进行中。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

水稻OsWAX2—1基因过表达及RNAi研究

为了研究水稻OsWAX2-1基因的功能,采用农杆菌介导法,以日本晴为材料,利用OsWAX2-1基因过表达及RNAi载体进行了遗传转化,并以PCR及半定量RT-PCR方法对具有Hyg抗性的转基因水稻植株进行了检测,结果表明:OsWAX2-1基因及RNAi片段均已整合到水稻基因组,RT-PCR检测到转OsWAX2-1基因在T1代转基因水稻中有不同程度的过表达,为进一步研究OsWAX2-1基因的功能奠定了基础.     

水稻OsCERK2转基因后代的鉴定与分析

为了研究水稻Os CERK2基因的功能,构建了Os CERK2基因过表达和RNAi载体,利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因植株,经多代筛选和分子检测,获得了4个超量表达的过表达纯系和2个转录水平下降的RNAi纯系。转基因植株经病原微生物细胞壁成分喷雾处理,采用半定量RT-PCR方法分析转基因植株中病程相关(PR)基因的表达情况,结果发现,诱导后过表达植株中PR基因表达增强,而RNAi植株中表达下降;抗病性鉴定结果表明,过表达转基因植株对白叶枯菌致病小种PXO99的抗性增强,而RNAi植株与野生型差异不显著。结果表明,过量表达Os CERK2基因可能是水稻抗病的有效途径。     

抑制OsPUT5基因表达降低水稻低温抗性

为研究水稻(Oryza sativa)多胺转运蛋白(polyamine uptake transporters, PUT)的功能，利用生物信息学方法对水稻中OsPUT家族成员进行鉴定，并对OsPUT5蛋白结构进行分析，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测OsPUT5基因在水稻不同组织中的表达情况，最后利用水稻超表达(overexpress, OE)株系、日本晴(Nipponbare,Nip)株系和RNAi株系初步研究OsPUT5基因的功能。结果表明，水稻中含有6个OsPUT,其中OsPUT5是一种含有10个跨膜结构域，且N端和C端均位于细胞膜外，并具有腐胺-鸟氨酸逆向转运蛋白PotE特有结构域的膜蛋白。基因表达模式显示，OsPUT5基因在叶片中表达量最高，在根、茎和花中无显著差异(P>0.05)。在生命周期内，正常条件下，OE株系、Nip株系和RNAi株系无明显的表型差异。在水稻幼苗期，4℃处理30 h后，RNAi株系、Nip株系和OE株系的相对电导率、丙二醛含量和脯氨酸含量均显著(P<0.05)升高，且表型都受到一定程度的影响。与Nip株系和OE株系相比，RNAi...     

RNA干扰技术及其在水稻基因功能研究中的应用

 随着水稻全基因组测序的完成，探究水稻中许多未知基因的功能成了当前的研究重点之一。RNA干扰技术(RNAi)作为新发展起来的基因功能研究方法正在被广泛采用。以农杆菌介导转化水稻技术也逐渐成熟。简要综述了RNAi作用机制及其在水稻基因功能研究中的应用的最新进展。     

OsKAT3 RNAi转基因水稻植株的构建

[目的]本研究以水稻‘日本晴’为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻气孔调控型钾吸收通道OsKAT3进行功能研究。[方法]通过将OsKAT3与拟南芥和水稻中的KAT类钾通道进行同源性比对,找到编码此蛋白基因C端的一段特异区域,并用于OsKAT3 RNAi表达载体的构建。设计含有相应酶切位点的引物扩增该特异片段,以OsKAT3作为模板进行RNAi-OsKAT3顺式和反式目的片段的PCR扩增。经菌落PCR鉴定挑选阳性克隆后送测序,测序结果表明:RNAi-OsKAT3顺式和反式目的片段均已正确连接到p MD19-T载体上,分别利用SacⅠ/SpeⅠ和Bam HⅠ/KpnⅠ酶切RNAi-OsKAT3顺式和反式目的片段,并将其连接到含有发夹结构的质粒p TCK303上,然后采用农杆菌介导的方法将经酶切验证正确的OsKAT3RNAi表达载体转化到水稻‘日本晴’中。[结果]以表达载体p TCK303多克隆位点两侧的通用引物进行转基因阳性植株鉴定,PCR结果显示OsKAT3顺式和反式特异片段已成功整合到再生水稻植株基因组中,定量PCR结果也证实RNAi转基因植株中OsKAT3基因表达被成功抑制。[结论]通过RNAi技术成功沉默了OsKAT3基因并获得T0代种子,为后续研究该基因功能奠定了一定基础。     

拟南芥血红蛋白1（AtGLB1）超量表达载体和RNAi表达载体的构建及转化

为研究拟南芥血红蛋白1基因(AtGLB1)的功能,将AtGLB1基因构建入超表达载体pMD和RNAi载体pZYI中,并采用花序浸染法将重组质粒转化拟南芥Columbia得到了转基因植株。对超表达株系和RNAi株系的纯合体进行Northern分析,结果表明:超量表达的拟南芥株系中AtGLB1的表达水平比野生型高很多,而表达被抑制的RNAi株系中几乎检测不到AtGLB1基因的表达。这些AtGLB1表达水平不同的拟南芥株系的获得可为该基因功能的后续研究以及在农业生产中的应用奠定一定基础。     

水稻基因OsAFC2参与mRNA可变剪切调控

mRNA的可变剪切受到SR蛋白磷酸化水平的精确调控,AFC2作为SR蛋白激酶,能够影响mRNA可变剪切。在水稻RNAi突变体库中发现一个Os AFC2基因沉默突变体,进一步研究显示该基因定位于细胞核内,在水稻的各个组织部位均有表达,其中在叶片中表达量较高,在茎中表达量较低。与对照相比,在Os AFC2抑制表达的植株中,检测到的可变剪切数量明显增加,表明Os AFC2参与水稻细胞核中mRNA可变剪切的调控。     

水稻OsWRKY78转录因子响应盐胁迫的表达与功能研究

以OsWRKY78基因及其相应的RNAi转基因水稻为研究对象,分析OsWRKY78转录因子响应盐胁迫的表达和功能,研究WRKY转录因子参与水稻耐盐的机制。结果表明:水稻OsWRKY78基因启动子中存在30多个与非生物胁迫相关的顺式调控元件。基因表达和GUS组织化学染色分析表明OsWRKY78的表达受盐诱导。抑制OsWRKY78基因表达可显著增强水稻在种子萌发和小苗生长阶段的耐盐性,一定程度上是通过调节OsLEA3、OsRAB21等与逆境相关基因的表达来实现的。     

RNAi在昆虫基因功能研究中的应用进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由小分子dsRNA引起目的基因mRNA序列特异性降解,导致靶标基因沉默或表达量下调的现象。RNAi在昆虫重要生理酶相关基因功能的研究中起着至关重要的作用。本文主要对RNAi不同方法的应用、各方法的优缺点及影响RNAi效率的因素进行了综述,总结了RNAi不同方法对昆虫功能基因沉默效果的差异,及在昆虫基因功能研究中的应用进展。     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。     

RNAi在哺乳动物中的研究新进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种高度保守的、基于RNA水平的特异性降解机制,它通过特异性地抑制基因的表达来快速、简便以及大规模地鉴定基因的功能。虽然dsRNA不能应用于哺乳动物,但是小分子干扰型RNA（siRNA）的技术却证明RNAi可以成功应用于哺乳动物。近年来,RNAi技术在哺乳动物中得到了飞速发展和广泛应用,包括设计更加合理、更加有效的siRNA,在更多的已经分裂或者尚未分裂的细胞系中诱导RNAi,通过瞬时RNAi或转基因RNAi在活体动物中抑制基因的表达,建立时空调控或组织特异性的RNAi以及利用RNAi对哺乳动物基因组功能进行大规模的筛选和鉴定。本文对近几年RNAi在哺乳动物中的研究新发展进行综述。     

OsCtBP-A基因过量表达和RNAi沉默对水稻根系生长和抗性的影响

为了阐明己克隆的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的功能,构建了该基因的过量表达和RNAi沉默载体,通过农杆菌介导转化水稻品种日本晴愈伤组织,分别获得了45个过量表达和75个RNAi 沉默T0代转基因植株,并进行了PCR和GUS染色鉴定。T1代过量表达株OsCtBP-A基因表达量明显增加,苗期根系生长增加,对水稻白叶枯病抗性无明显变化;而基因沉默株OsCtBP-A基因表达量显著下降,苗期根系发育迟缓,抗旱性明显降低,抗病性减弱。表明OsCtBP-A基因的表达可能对水稻苗期根系发育、抗旱性和抗病性具有不同程度的调控作用。     

水稻TWH基因RNAi载体的构建及遗传转化

根据RNAi表达载体的设计原则,以TWH基因为靶基因,将长度253 bp目的片段通过正反两个方向插入表达载体pR1301中,构建RNAi表达载体pR1301-TWH.通过根癌农杆菌EHA 105介导法将其导入水稻品种武育粳3号,获得34株阳性转基因植株,为进一步深入研究TWH基因功能奠定了基础.     

转基因RNAi技术在番茄研究中的应用

RNAi(RNA interference)技术是一项基因沉默技术,能够阻断特定基因的表达,从而为探索未知基因的功能提供了一个很好的反向遗传学研究平台。番茄作为一种重要的蔬菜作物和模式作物,RNAi技术在其遗传改良进程中已得到了广泛应用。本文对RNAi技术在番茄基因功能、品质性状的遗传改良、抗病研究中的应用进展及其应用前景进行了综述。     

水稻OsLecRK基因RNAi载体的构建及遗传转化

凝集素类受体蛋白激酶(Lectin-like receptor kinase,Lec RK)是一类植物特有并分布广泛的蛋白激酶。采用RT-PCR从水稻(Oryza sativa L.)品种B5中克隆了Os Lec RK基因靠近翻译起始位点下游的530 bp的特异基因片段,将该片段以正、反向分别连入p KANNIBAL载体,从而获得p KAN-Os Lec RKRNAi的中间表达载体,进而将其克隆到植物双元表达载体p CAMBIA1301中,构建ds RNAi表达载体p CAMBIA-Os Lec RK-ds RNAi。经酶切和测序鉴定正确后,利用农杆菌介导转化水稻,通过抗性筛选和标记基因hyg进行PCR鉴定,筛选出12株转基因水稻植株。     

非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰

非洲绿猴肾细胞(Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白(GFP)基因转染到Veto-E6中,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)其表达进行干扰。结果显示：siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero-E6细胞中的表达,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero-E6细胞中,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。     

双价RNA干扰载体转基因水稻抗飞虱研究

借助转基因技术，培育稳定遗传表达靶向昆虫基因dsRNA的转基因植物，对于防治刺吸式害虫褐飞虱具有潜在意义。研究在已获得V-ATPase D和V-ATPase H亚基基因片段的融合基因，并通过体外合成dsRNA喂食褐飞虱若虫后导致死亡率增加的基础上，构建了该融合基因的pcambia 1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi植物表达载体，转化日本晴水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.11)获得转基因植物，褐飞虱若虫取食转基因植株后飞虱体内靶标基因的转录水平有所下降，同时飞虱发育历期和世代周期有所延长，虽然没有造成飞虱的死亡，但双价RNAi载体的构建为利用RNAi技术进行植物抗飞虱研究奠定了基础，同时通过技术改进提高RNAi抗飞虱水平，可进一步培育出抗飞虱转基因水稻。     

水稻蛋白激酶OsCIPK5的亚细胞定位分析及RNAi转基因水稻的获得

在植物生长发育中,CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在胁迫信号转导和增强抗逆途径中发挥着重要作用,而OsCIPK5的具体功能还未知。为了研究OsCIPK5的功能,本研究从日本晴水稻中成功克隆了OsCIPK5基因。用生物信息学方法对其编码的蛋白进行分析,结果表明OsCIPK5含有2个功能区即激酶活性区和NAF区,OsCIPK5与5种植物的CIPK5同源性较高,而与短花药野生稻CIPK5的同源性最高(94%),亲缘关系最近。利用植物生理学方法对水稻进行低钾处理,结果表明水稻根中OsCIPK5受低钾诱导表达,而叶片中OsCIPK5表达量没有变化;同时构建了OsCIPK5与黄色荧光蛋白基因融合的植物瞬时表达载体,共聚焦显微镜观察显示,OsCIPK5编码的蛋白主要定位在细胞核、细胞膜,还以颗粒状结构不规则分布在细胞质中。进一步构建了OsCIPK5的RNAi载体,通过水稻遗传转化体系获得26株阳性转基因水稻。荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析表明,T1代转基因水稻中OsCIPK5的表达量与野生型相比显著降低。OsCIPK5的生物信息学分析、植物生理学分析、亚细胞定位以及RNAi转基因水稻的获得为研究OsCIPK5的功能奠定了基础。