科技动态

正H5N1亚型禽流感病毒对鹌鹑具有高度致死性中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的科研人员探讨了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)对鹌鹑的致病性及其接触传播能力。研究选择2009~2012年分离的3株Clade 2.3.2病毒株DK/GD/1322/10、DK/GZ/4102/10、GCG/QH/1/09和1株Clade 7.2病毒株CK/NX/2/12,以105EID50的剂量,人工感染4周龄鹌鹑,并于感染后24 h放入同居鹌     

重组禽流感病毒二价灭活疫苗对H5N1亚型7.2分支病毒的攻毒保护性研究

为有效防控2006年以来出现的H5亚型7.2分支禽流感病毒(AIV)引起的免疫鸡群高致病性禽流感(HPAI)的流行,我们构建了重组AIV Re-4疫苗株,研制出含有重组AIV Re-4株的H5亚型二价系列灭活疫苗,并在我国北方地区使用,有效地控制了其流行。2012年我国北方地区再次出现7.2分支病毒引起的HPAI疫情。为评估现有H5亚型二价系列灭活疫苗对该分支病毒的免疫保护效力,本研究首先通过SPF鸡进行免疫攻毒试验评估。结果表明,分别以每羽份(0.3 mL/只)的Re-5+Re-4株和Re-6+Re-4株重组AIV H5二价油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫3周后针对重组AIV Re-4株的HI抗体均达到8 log2以上;经鼻腔接种7.2分支AIV CK/NX/2/12株(100 LD50)攻毒后,免疫鸡均获得完全保护,即无任何临床症状和排毒现象,而对照组SPF鸡全部发病死亡。此外,以哈尔滨当地养殖场中免疫H5亚型AIV灭活疫苗的48只商品蛋鸡进行攻毒试验,结果显示,商品蛋鸡血清中针对重组AIV Re-4株HI抗体平均滴度为8.3 log2,采用相同方式攻毒后也获得完全保护。本研究结果表明,Re-5+Re-4株和Re-6+Re-4株重组AIV H5二价灭活疫苗均能够对H5亚型7.2分支病毒的攻击提供良好的免疫保护效果。     

禽流感H5N1亚型不同株抗原抗体相互检测相关性试验

禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）是禽流行性感冒（简称禽流感,Avian Influenza,AI）的病原。其中高致病性的H5N1亚型AIV可以造成鸡群的大批死亡,对家禽养殖业影响严重,并可引起人的感染和死亡。通过接种疫苗能有效地控制禽流感的传播,在禽流感疫苗免疫效力的评价过程中,监测免疫鸡血清抗体是最常用、最可行的方法。2009年农业部批准重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-5株+Re-4株）制造,2012年重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-6株）及重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-6株+Re-4株）取代以上两个产品,2014年,北方出现了新的7.2分支毒株,而禽流感Re-4株疫苗和Re-6株疫苗对这种新型流行株的保护效力并不佳。2014年4月11日,农业部发布“中华人民共和国农业部公告第2093号”,制定了重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型, Re-7株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株）2种兽药产品制造及检验规程,全国将主要以Re-6与Re-7两种疫苗联合免疫为新的趋势。本试验分别用不同毒株的禽流感试验抗原与不同毒株禽流感疫苗免疫鸡的血清通过HI试验相互检测,对抗体效价进行分析,从而得出不同毒株的相关性。     

采用反向遗传学技术构建clade7..2 H5N2亚型禽流感病毒高产疫苗株

为构建H5N2亚型禽流感病毒(AIV)高产疫苗株,研究采用反向遗传操作技术删除Clade 7.2 H5N2亚型AIV A/chicken/Shanxi/Q6/2013(wt-Q6株)血凝素(HA)基因多碱性氨基酸序列,以wt-Q6株HA和神经氨酸酶基因为供体,结合A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的6个内部片段骨架,构建针对此种变异的H5亚型AIV疫苗株,成功拯救出一株重组病毒r Q6/PR8。该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖滴度,对SPF鸡胚和鸡无致病性,具有低毒高产的特性,符合疫苗候选株的标准。     

Clade2.3.2 H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建

近年来Clade2.3.2H5N1亚型的禽流感病毒逐渐成为我国及越南等其他一些国家流行的优势毒株,并呈现出一定变化规律的氨基酸进化趋势。本研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV为内部基因供体,以Clade2.3.2H5N1亚型AIV A/chicken/Yangzhou/1117/2011(YZC3)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体,通过反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的COS-1细胞中救获低致病性的疫苗毒株。结果成功拯救出1株重组病毒rYZC3,该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,对SPF鸡和鸡胚无致病性。本研究为防控当代流行的H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。     

禽流感H5N1亚型不同株抗原抗体相互检测相关性试验

禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）是禽流行性感冒（简称禽流感,Avian Influenza,AI）的病原。其中高致病性的H5N1亚型AIV可以造成鸡群的大批死亡,对家禽养殖业影响严重,并可引起人的感染和死亡。通过接种疫苗能有效地控制禽流感的传播,在禽流感疫苗免疫效力的评价过程中,监测免疫鸡血清抗体是最常用、最可行的方法。2009年农业部批准重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-5株＋Re-4株）制造,2012年重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-6株）及重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-6株＋Re-4株）取代以上两个产品,2014年,北方出现了新的7．2分支毒株,而禽流感Re-4株疫苗和Re-6株疫苗对这种新型流行株的保护效力并不佳。2014年4月11日,农业部发布“中华人民共和国农业部公告第2093号”,制定了重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-7株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6株＋Re-7株）2种兽药产品制造及检验规程,全国将主要以Re-6与Re-7两种疫苗联合免疫为新的趋势。本试验分别用不同毒株的禽流感试验抗原与不同毒株禽流感疫苗免疫鸡的血清通过HI试验相互检测,对抗体效价进行分析,从而得出不同毒株的相关性。     

Clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感疫苗候选株的构建

2015年秋季以来,clade2.3.4.4的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)分离率逐渐增加,成为我国华东地区流行的优势毒株。经遗传进化分析发现,与抗原性相关的血凝素(HA)氨基酸呈现出一定规律的进化趋势,导致抗原性发生变化。研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)AIV为内部基因供体,以clade2.3.4.4中的H5N2亚型毒株A/chicken/Yangzhou/YZ1111/2015(YZ1111)的表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)为外部基因供体,并删除YZ1111株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,通过反向遗传操作,成功拯救出1株重组病毒r YZ1111。r YZ1111在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。表明在分析H5N2亚型AIV抗原变异的基础上研发出疫苗候选株,为防控变异的clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感提供了备选疫苗。     

一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV)，命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8)，简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性，本研究对其基因组测序并经遗传演化分析，结果显示，该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF，符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支，外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年～2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高，且处于同一分支；PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高，为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高，且处于同一分支，推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示，该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示，该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制，但其在A549中的复制效率高于其在MD...     

华南农业大学教授廖明:目前国内流行H5亚型禽流感病毒,其重组疫苗的构建应在抗原性方面实现全覆盖

<正>H5亚型禽流感的流行特征多血清亚型当前H5N1、H5N2和H5N6等多个血清亚型的毒株同时在禽群中出现,其中H5N6亚型成为优势亚型,而H5N8亚型病毒在家禽中已鲜见报道。多基因型Clade2.3.4.4基因型为主要流行分支;Clade 2.3.2.1基因型毒株的数量迅速下降,分布区域大幅减少;而Clade 7.2基因     

第2.3.2.1分支H5亚型禽流感变异株候选疫苗株的构建及免疫效力试验

第2.3.2.1分支H5N1亚型禽流感病毒(AIV)抗原性目前已发生显著变异。为应对变异株可能引发的流行,利用反向遗传技术,以鸡胚适应毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N1亚型AIV A/duck/JS/ZJ/2016(H5N1)(ZJ,第2.3.2.1d分支)、A/Chicken/SD/YT/2015(H5N1)(YT,第2.3.2.1e分支)的基因组为模板,扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行修饰,去除裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征,成功构建了第2.3.2.1分支H5N1亚型AIV疫苗候选株rZJ和rYT。抗原性分析显示,rZJ和rYT与Re-6疫苗株之间的抗原性已有显著差异。免疫效力试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗免疫21 d的平均HI抗体效价分别达到8.8 log2和8.9 log2,说明重组疫苗具备良好的免疫原性。免疫攻毒保护试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源H5N1病毒100%的保护,而针对第2.3.2.1分支的Re-6疫苗仅能提供大约40%和30%的保护。利用反向遗传技术构建的rZJ和rYT重组候选疫苗株为该分支病毒的防控提供了技术支持。     

Re-8株H5亚型禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫保护性研究

为评估当前应用的Re-8株种毒相关禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫预防效果,本研究将重组禽流感病毒(AIV)H5亚型Re-8株灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8株)和重组AIV(H5+H7)灭活疫苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7 Re-1株)分别以0.3 m L/只的剂量接种3周龄SPF鸡,免疫3周时进行HI抗体检测和攻毒试验。结果显示,上述2种疫苗免疫的SPF鸡血清中针对H5亚型Re-8株抗原的HI抗体均在8 log2以上,以105EID50的剂量、鼻腔感染途径攻击野鸟源H5N8病毒BHG/QH/2/16和BHG/Tibet/3/16后,所有免疫组鸡在14 d观察期内均全部健活,不排毒,而对照组鸡在攻毒后4 d内全部发病、死亡、排毒。现地免疫重组AIV H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)的商品蛋鸡直接进行HI抗体检测和攻毒试验,结果显示,免疫蛋鸡血清中针对Re-8株抗原的HI抗体平均滴度为8.3 log2,以相同攻毒方式和剂量分别攻击2株H5N8病毒后,免疫鸡也获得完全免疫保护,不发病、不死亡、不排毒。本研究结果表明,含有重组AIV H5 Re-8株抗原的灭活疫苗可有效防控野鸟源H5N8流感病毒,为我国及其他国家H5N8亚型禽流感免疫防控提供了科学依据。     

Clade 2.3.2e H5亚型禽流感DNA疫苗的免疫保护效力研究

为研制和更新针对H5亚型禽流感病毒(AIV)流行株的DNA疫苗,本研究将新近分离的H5亚型AIV Clade2.3.2e分支代表株A/Duck/Anhui/S1246/2015 (DK/AH/S1246/15)密码子优化的HA基因定向克隆至载体pCAGGS中构建重组质粒pCA-S1246,将该质粒转染293T细胞。利用间接免疫荧光和western blot检测,结果显示, HA蛋白可以在293T细胞中正确表达。将15μg、 30μg和60μg的p CA-S1246质粒分别免疫3周龄的SPF鸡, 3周以后以相同的剂量加强免疫后1周,检测其HI抗体平均效价分别可达1∶56、 1∶16和1∶37;加强免疫1周后用105EID50的DK/AH/S1246/15进行攻击时,免疫组的保护率为100%。本研究为DNA质粒pCA-S1246作为防控Clade.2.3.2e AIV的候选DNA疫苗株提供了实验依据。     

H5亚型高致病性禽流感病毒抗原性变异分析

为深入了解我国H5亚型高致病性禽流感病毒的抗原性变异情况及其规律,对我国2012—2015年分离的H5亚型高致病性禽流感病毒进行了HA基因的扩增、测序与遗传进化分析。结果发现这些流行毒株主要分布在第2.3.2.1分支、第2.3.4.4分支和第7.2分支。制备流行毒株的单因子阳性血清,与相应疫苗株进行交叉血凝抑制试验,计算抗原相关系数,并对各分支流行毒与相应疫苗之间的HA1主要抗原位点差异进行分析。结果表明,Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8疫苗株之间的血凝抑制抗原相关系数在0.17~0.67之间,表明不同分支之间的抗原性有较大差异。随着时间的推移,分支内流行毒与疫苗之间的血凝抑制抗原相关性差异会越来越大,抗原性变异程度增加,这与HA1主要抗原位点差异分析的结果一致。因此,要取得理想的防控效果,必须及时更新疫苗,使用与流行毒匹配性更好的疫苗。这些数据为深入了解H5亚型高致病性禽流感病毒的抗原变异和对该病毒的防控提供了技术支持。     

高通量测序一株天鹅源H5N8亚型流感病毒遗传演化分析

为研究一株天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化规律,本研究对2016年从山西省疾控中心送检天鹅样品中分离到的一株H5N8亚型流感病毒(A/swan/Shanxi/6/2016)的全基因组序列进行高通量测序及遗传演化分析。结果显示,分离的病毒为Clade 2.3.4.4分支高致病禽流感病毒(HPAIV);BLAST分析显示该分离株的NP基因与H3N8亚型AIV的NP基因具有较高同源性,而其它基因节段则分别与来自其它国家的H5N8亚型AIV的相应基因节段同源性较高,进一步选取与各基因节段核苷酸同源性较高的病毒株作参考序列构建其系统进化树,推测该分离株为一株重组病毒株。特殊氨基酸位点分析显示,其具有典型的禽型受体结合位点和典型的人型受体结合位点。并且M1蛋白、NS1蛋白和PB2蛋白具有H5N1亚型AIV对鼠致病性增强的分子标志,提示该株野鸟源流感病毒可能具备感染哺乳动物的能力。本研究对H5N8亚型AIV的综合防控具有一定的指导意义。     

禽流感流行及疫苗研究

一、2013-2014年我国主要禽流感疫情概况 农业部新闻办2013年12月发布,在河北保定发生一起家禽高致病性禽流感疫情,2014年1月山东青岛蛋鸡养殖场中分离到H5N2亚型高致病性禽流感病毒,上述分离到的病毒均属于禽流感H5亚型7.2分支病毒,这类病毒与现在应用的Re-4株疫苗属于同一分支,在部分北方省份也监测到该病毒,Re-4株疫苗是目前预防该病毒唯一合法的有效疫苗,但由于流行株与疫苗已经存在了变化,因此对其不能完全保护.     

乌昌地区三黄鸡免疫不同禽流感疫苗及不同免疫剂量的抗体水平测定和效力对比试验

用5种不同的禽流感疫苗以不同免疫剂量、不同免疫次数接种乌昌地区三黄鸡,定期检测禽流感免疫抗体,结果表明,重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)、Inactivated Vaccine of Avian Influenza(H5N2)和禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗(H5N1Re-1+H9N2 Re-2株)等3种疫苗均能刺激机体产生良好的免疫抗体,而禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rL-H5株)和禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)的免疫抗体十分低下。经不同免疫次数的比较试验表明,重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)、Inactivated Vaccine of Avian Influenza(H5N2)和禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗(H5N1Re-1+H9N2 Re-2株)二次免疫的H5抗体水平明显高于经一次免疫的抗体水平,且免疫持续期长。     

一株H4亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传演化分析

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定一株H4亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(缩写为DK/GX/912/08)。为了解该株H4亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定,并与GenBank登录的相关病毒进行遗传演化分析。结果表明:DK/GX/912/08HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于东半球谱系的欧亚分支;NA基因与A/duck/Jiangxi/1286/2005(H5N2)在同一分支内,核苷酸同源性为98.1%;PB2基因与A/duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)处于同一分支;而NS基因与A/duck/Jiangxi/1786/03(H7N7)同源性最高。因此,推测DK/GX/912/08可能是不同来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

H5N6亚型禽流感病毒反向遗传疫苗株的构建及免疫保护试验

为应对抗原性已发生变异的第2.3.4.6分支H5N6亚型禽流感病毒(AIV)引发的潜在流行,本研究利用反向遗传操作技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N6亚型AIV A/Chicken/SC/6/2014(C6)的基因组为模板,经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PLRERRRKR-突变为-PQRETR-),成功构建了H5N6亚型AIV疫苗候选株r C6。免疫效力试验表明,r C6重组灭活疫苗可以诱导产生高水平的血凝抑制抗体。免疫攻毒保护试验表明,r C6重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源和异源H5N6病毒100%的保护,而针对第2.3.4分支的Re-5疫苗仅能提供大约10%的保护。利用反向遗传技术构建的r C6重组疫苗候选株为该分支病毒的防控提供了有益的尝试。     

重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型）对鸭和鹅的免疫效果观察

由H5N1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, HPAI）是禽类的一种烈性传染病,疫苗免疫是禽流感防控中的重要环节。本试验采用重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1,Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1、Re-5株+Re-4株）进行了鸭和鹅的免疫试验,对免疫鸭和鹅的抗体水平进行了动态监测。试验结果表明,两种疫苗对鸭和鹅均具有良好的免疫效果。基于试验结果提出了鸭和鹅禽流感免疫程序：2 w左右首免,4~5 w时二免,开产前三免,此后每隔4~5个月加强免疫一次。     

不同种类禽流感疫苗对番鸭的免疫效果对比试验

为评价重组禽流感病毒灭活疫苗鸡胚源H5N1亚型Re-6株、鸡胚源H5N1亚型Re-6+Re-8株灭活疫苗、细胞源Re-6+Re-8株灭活疫苗及水禽专用H5N2亚型D7株灭活疫苗4个产品对番鸭的免疫效果,分别取四种疫苗分别免疫20日龄番鸭,125只/组,免后35日采血测定HI抗体效价。结果表明,4种疫苗免疫后用Re-6抗原检测抗体依次分别为8.1log2、9.3log2、8.9log2、7.0log2,用Re-8抗原检测抗体分别为1.5log2、9.9log2、8.7log2、7.5log2,用D7抗原检测抗体分别为0.3log2、7.6log2、5.6log2、6.5log2。四种疫苗免疫效果由高至低依次为:鸡胚源H5N1亚型Re-6+Re-8株灭活疫苗细胞源Re-6+Re-8株灭活疫苗H5N2亚型D7株灭活疫苗鸡胚源H5N1亚型Re-6株灭活疫苗。