抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究

利用基因重组技术,将木霉几丁质酶基因(Chi)和β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)进行融合并将其引入含bar基因的载体pAHC25中,成功构建了由Ubiquitin启动子分别驱动Chi-linker-Glu和bar的中间载体,然后将其上的Ubi-Chi-linker-Glu-nos和Ubi-bar-nos表达盒引入pBI121中,获得兼具除草剂抗性基因bar和真菌抗性基因Chi与Glu的三价植物表达载体pBIb-CG,并对烟草进行遗传转化,经PCR及Southern检测,共获得转基因烟草32株。外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验表明转基因烟草叶片提取液对木霉菌和镰刀菌表现出一定的抗性。     

钙依赖蛋白激酶基因表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

将钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因插入到植物表达载体pBI121上,构建成特异性表达载体pBI121-CDPK,并采用农杆菌介导法将其转化进入拟南芥Arabidopsis thaliana Columbia生态型品种中,获得了卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,拟南芥基因组中含有此抗性基因.     

紫花苜蓿MsFPS基因超表达载体的构建及烟草转化

采用RT-PCR技术获得紫花苜蓿的法呢基焦磷酸合成酶基因,并连接到含有35S启动子和GUS基因的载体pBI121上,成功构建植物表达载体pBI-FPS.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得7株卡那霉素抗性苗,对其中的4株进行PCR检测,证明目的基因已经整合到烟草基因组中.进一步对这4株进行RT- PCR和组织化学染色法检测,初步证实目的基因在烟草中可以表达,说明已成功获得能够表达MsFPS基因的转基因烟草.     

杨树木质部特异启动子MDCesAP的改造及功能检测

木质部特异表达的强启动子有助于外源目的基因在植物木质部中高效表达。将2个杨树木质部特异启动子MDCe-sAP串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建成pDMDCesAP-GUS植物表达载体,通过农杆菌介导,并采用叶盘法转化烟草,获得烟草抗性植株。β-葡糖醛酸酶(GUS)活性检测结果表明,该串联启动子DMDCesAP具有木质部特异性,有望应用于桑天牛寄主树种的抗虫转基因研究。     

紫花苜蓿MsZFN基因超表达载体的构建及对烟草的转化

对紫花苜蓿一种新的CCCH类型锌指蛋白基因进行克隆及转化到烟草中,为研究该基因的功能提供依据。将紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(EU624138)连接到载体pBI121上,构建成植物表达载体pBI-ZFN。将表达载体转化到感受态农杆菌株LBA4404中,利用农杆菌介导的方法,以烟草无菌苗叶片为外植体,转化烟草,经卡那霉素筛选获得十几个烟草再生植株。对其中四个再生植株进行PCR和Southern检测,证明目的基因已经整合到烟草基因组中,通过RT-PCR检测,初步证明目的基因在烟草中可以表达。     

东方山羊豆GoGID基因表达载体构建及紫花苜蓿转化

根据已经克隆得到的东方山羊豆赤霉素受体(GoGID)基因,扩增编码区cDNA.以pBI121为基础载体,采用酶切连接法,构建植物超表达载体pBI121-GoGID.酶切鉴定表明:目的基因已经正确插入载体中,超表达载体构建成功.采用CaCl₂冻融法将重组载体转入农杆菌菌株中.以叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织培养法,转化紫花苜蓿(Medicage sativa),得到抗性苗.对载体携带的nptⅡ基因、GUS基因进行PCR检测均成阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中.同时对转基因植株进行Southern-blot及RT-PCR检测,并均得到目的条带.本研究为进一步分析GoGID基因对紫花苜蓿生物量影响奠定了基础.     

紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化

柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中克隆柠檬酸合成酶基因(MsCS),以期获得该基因全长,并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用cDNA末端快速扩增方法(RACE),克隆获得MsCS的cDNA全序列,然后利用pBI121构建植物超表达载体pBI-MsCS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。结果显示:该基因序列全长为2031 bp,开放阅读框1551 bp,编码517个氨基酸,与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得17株卡那抗性植株。经PCR检测有6株为阳性植株,初步表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

紫花苜蓿MsPOD基因的克隆及对拟南芥的转化

利用RT-PCR技术从紫花苜蓿中克隆出过氧化物酶基因,命名为MsPOD,并通过DNA重组技术将其连接到载体pBI121上,成功构建植物表达载体pBI-MsPOD;将表达载体转化到感受态农杆菌株GV3101中,利用花序浸泡法获得具有卡纳抗性的转基因拟南芥植株.对其中3个再生植株进行PCR检测表明,目的基因已经成功整合到拟南芥基因组中,通过RT-PCR和GUS染色检测分析,初步证明目的基因在拟南芥中成功表达.     

日本血吸虫铁蛋白基因在油菜中的表达

根据GenBank日本血吸虫铁蛋白基因(SjFer)的序列设计1对特异性引物,利用PCR从cDNA文库中扩增SjFer基因,与T载体连接并测序。常规方法构建植物表达载体SjFer/pBI121,采用根癌农杆菌介导法转化油菜子叶,组织培养卡那霉素抗性筛选,获得转化植株。转化植株通过PCR和Northern-blot杂交进行鉴定。结果表明SjFer可在油菜中正确表达。该研究为进一步研究转基因油菜工程疫苗奠定了基础。     

aFGF植物表达载体构建及转化紫花苜蓿的初步研究

主要将aFGF基因按照植物偏爱的密码子进行基因优化,同时加上信号肽、6-组氨酸标签及凝血酶切割因子,合成全基因,再将基因插入到改造的TΩ4AB质粒中,将aFGF基因和质粒上的增强子、启动子、Ω序列及ployA加尾序列双酶切,命名为TΩ4AB-aF,将TΩ4AB-aF插入到pBI121载体中命名为pBI121-TΩ4AB-aF。利用三亲融合法将pBI121-TΩ4AB-aF转入到农杆菌菌株LBA4404中,转化苜蓿。转基因苗用卡那霉素进行筛选;并对抗性苗进行PCR、RT-PCR、Western Blot检测。结果表明,aFGF在苜蓿中得到表达。为苜蓿作为植物生物反应器奠定理论基础。     

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化

为获得MsMYB2基因过量表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,利用PCR技术在紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆出MYB2基因并命名为MsMYB2,MsMYB2基因编码区全长834 bp,编码1条长度为278个氨基酸的多肽链。通过DNA重组技术将其与pBI121连接,成功构建了植物表达载体pBI-MsMYB2。通过花序侵染法获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,并通过PCR和RT-PCR对目的基因进行检测,结果证明目的基因已整合到拟南芥基因组中并且可以表达,成功获得了MsMYB2基因表达的拟南芥转基因植株。     

拟南芥CBF1基因的克隆分析与表达载体构建

CBF1转录激活因子是一类受低温诱导的反式作用因子,能有效提高植物抗低温的能力。本文通过PCR方法,以拟南芥叶片为材料,成功地克隆了CBF1转录因子基因,并将其连接到植物表达载体pB1121上,为通过农杆菌介导法转化牧草获得转基因植株奠定了基础。     

细叶百合LpWRKY20基因对非生物胁迫的响应及抗旱性分析

以细叶百合LpWRKY20基因为研究对象,通过荧光定量(qRT-PCR)分析该基因在不同非生物胁迫中的表达,结果表明,在不同非生物胁迫中该基因表达量存在差异。利用叶盘法将pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体转入烟草并获得转基因株系。在干旱胁迫条件下,转基因植株的表型优于野生型;转基因植株超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均高于野生型,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,具有较强的自我修复能力。干旱条件下表型及生理指标的变化均表明转基因植株具有较强的抗旱性,初步推断LpWRKY20具有抗旱的功能。     

转猪轮状病毒VP6基因烟草植物的获得

根据GenBank中轮状病毒VP6序列设计1对引物，从pGEM—T—VP6质粒中扩增VP6PCR产物。将VP6克隆到PBI121质粒中，转化根癌农杆菌LBA4404，挑取阳性菌落的质粒进行酶切鉴定。用叶盘法转化烟草，获得再生苗，用RT—PCR、PCR和PCR—southern杂交方法进行鉴定，结果表明，VP6基因已成功地转入烟草中。     

AtPCS1基因表达载体构建与转化苜蓿的研究

扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)螯合肤合成酶(AtPCS1)全长基因;构建AtPCS1植物表达载体pBI 121-AtPCS1,进一步转化农杆菌EHA105;利用转化的农杆菌EHA105侵染甘农一号苜蓿(Medicago satiua)叶片,经过80～100 d的筛选与培养,获得57株再生转基因植...