抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的研究——禽脑脊髓炎病毒抗原的培养和纯化

为获得用于制备AEV单克隆抗体的抗原，将禽脑脊髓炎病毒（AEV VR）接种于鸡胚成纤维细胞（CEF）盲传，通过间接免疫荧光试验（IFA）监测AEV增殖情况，以第六代CEF培养物作为种毒扩大培养，将其培养物经差速率心后的半提纯物接种6日龄SPF鸡胚、1日龄SPF鸡，再将半提纯物经密度梯度离心后进行PAGE－SDS电泳，电镜观察。结果证实，AEV VR在CEF上增殖成功。     

用蔗糖密度梯度离心法提纯禽脑脊髓炎病毒

用蔗糖密度梯度离心法进行了禽脑脊髓炎病毒的纯化.将禽脑脊髓炎病毒(AEV)L2Z株、Van Roekel株和1143株分别经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚,接毒后13天,收集脑、消化道及胰腺,用玻璃匀浆器制成10%的组织悬液.组织悬液经3次反复冻融后,以4500r/min离心15min,取上清液.而后用氯仿处理,取水相,经冷冻真空浓缩,进行不连续蔗糖密度梯度离心.取出含AEV的组分,用PBS稀释后超速离心除去蔗糖,得到提纯的病毒.病毒样品经2%磷钨酸负染,于电镜下观察可见典型的病毒粒子,大小为24～28nm.     

鸡胚不同接种途径对鸡安卡拉病毒徐州株增殖的影响

为了探寻鸡安卡拉病毒徐州株(FAdV-4 SN2016株)接种SPF鸡胚不同部位后的增殖规律,从而明确该病毒最为适合的接种途径及病毒收获组织,试验采用6～8日龄卵黄囊、9～10日龄尿囊腔以及9～10日龄尿囊膜3种接种途径对SPF鸡胚分别接种,培养数日后均收集接种鸡胚的尿囊液、尿囊膜及肝脏组织,采用实时荧光定量PCR方法测定尿囊液、尿囊膜及肝脏组织中的病毒载量。结果表明:FAdV-4 SN2016株在所收集的鸡胚各组织中均有病毒复制,3种接种途径获得的病毒载量最高的组织是卵黄囊途径接种后收获的肝脏组织,经尿囊腔途径接种鸡胚后在肝脏组织中的病毒载量也相对较高,而经尿囊膜途径接种鸡胚后在尿囊膜上的病毒载量也相对较高。说明不同接种途径对FAdV-4 SN2016株在SPF鸡胚中的增殖影响比较大,该病毒经卵黄囊途径接种鸡胚后在鸡胚肝脏组织中的增殖效果最好。     

禽脑脊髓炎琼扩抗原的研制和应用

将禽脑脊髓炎病毒（AEV）陕西分离株接种于6日龄鸡胚卵黄囊，16日龄时收取活胚脑、胃肠道和胰腺，匀浆灭活后制成琼扩抗原，该抗原与AE标准阳性血清在36h内出现特异性的沉淀线，而与ND、EDS－76、AI、IB阳性血清及SPF鸡血清不出现沉淀线，用其检测60份血清，48份呈AE阳性，与用标准抗原检测的结果一致。     

雏鸡传染性脑脊髓炎病毒的分离与初步鉴定

用神经胶质细胞培养和6日龄SPF鸡胚卵黄囊接种,分离出一株病毒,经免疫荧光及琼脂扩散试验,证明该病毒为禽传染性脑脊髓炎病毒.     

鸡毒支原体人工感染SPF鸡胚研究

试验使用低剂量的鸡毒支原体(MG)培养液(液稀释至10~4CCU/mL)经卵黄囊接种5~7日胚龄SPF鸡胚,结果:鸡胚死亡高峰时间发生在孵化后期(17d以后),疫苗6/85株导致SPF鸡胚死亡情况及死亡鸡胚病理变化与MG强毒S6株和临床分离株无明显差异。从孵化后期死胚中采集不同样品进行MG分离鉴定,最终确定死胚最佳分离部位为卵黄囊膜。     

利用鸡胚成纤维细胞培养禽脑脊髓炎病毒的研究

利用鸡胚成纤维细胞 (CEF)培养禽脑脊髓炎病毒 (AEV) ,经过六次盲传发现 :AEV在 CEF上无细胞病变 (CPE) ,但利用 CEF细胞上清接种 SPF鸡胚 ,可产生不同程度的 AE鸡胚病变。分别取不同时间的感染细胞上清 ,测定 AEV浓度 ,结合培养条件 ,进而确定 AEV培养的最佳时机。结果表明 :以 AEV在 CEF上培养 7天最好 ,病毒滴度可达 10 2 .8EID50 / 0 .2 ml。将经 CEF培养的 AEV差速离心 (浓缩约 5 0 0倍 ) ,接种 SPF鸡胚 ,可产生典型的鸡胚病变 ,其滴度为 8× 10 5.0 EID50 / 0 .2 m l。通过 Cs Cl密度梯度离心提纯病毒 ,在电镜下观察到了大小基本一致的病毒粒子 ,病毒直径约为 2 5 nm。利用 AEV感染的 CEF或通过“细胞飞片”制备荧光片 ,建立了间接免疫荧光快速检验 CEF是否感染 AEV的方法。     

AE油佐剂灭活疫苗对鸡胚和仔鸡的保护力试验研究

用三批AE（Avian Encephalomyelitis）油佐剂灭活疫苗免疫开产前种鸡，免疫后定期采集种蛋进行孵化，当孵至6日龄时取部分鸡胚，卵黄囊途径接种AEV VR株，进行鸡胚AE易感性试验，余鸡胚孵化出雏，分别为1、7、14、21日龄雏鸡采用肌肉途径攻击AEV VR株，攻毒后观察不同日龄仔代雏鸡AE的保护能力。结果疫苗免疫后2－3个月的种鸡所产种蛋的鸡胚AE易感性试验的保护率达100％，而同期所产种蛋孵出的仔代雏鸡，在出雏后3周内对AEV工VR株攻毒的保护率亦达100％，免疫后6－7个月种鸡所产种蛋的鸡胚AEV VR易感性试验的保护率达75％－805，而同期所产种蛋孵出的仔代雏鸡，在出雏后3周内对AEV VR株攻毒的保护率达70－90％。试验结果表明，鸡胚AE易感笥试验的鸡胚保护率与同批种蛋孵出雏鸡对AEV VR肌肉途径攻毒的保护率基本相同。     

鸡胚和雏鸡接种ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液的致病性比较

为了比较鸡胚接种ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液对胚体及雏鸡的致病性,将含ALV-J相关病毒的肉瘤浸出液分别经5日龄胚卵黄囊、11日龄胚绒毛尿囊膜、1日龄雏鸡腹腔接种,比较不同接种方式对SPF鸡胚及雏鸡的致病性.结果表明,5日龄卵黄囊接种的鸡胚在18～22日龄死胚率为14/30,肿瘤发生率为8/14; 11日龄绒毛尿囊膜接种的鸡胚在18～22日龄引起鸡胚死亡率为17/30,肿瘤发生率为6/17.对雏鸡的致病性比较表明,绒毛尿囊膜接种的13只出壳雏鸡全部死亡,有11只出现肿瘤.结果提示,绒毛尿囊膜接种的致病性不仅高于卵黄囊接种,也高于1日龄雏鸡接种.绒毛尿囊膜接种不仅肿瘤发生率高,且发生得更早、更快,可作为这种急性纤维肉瘤进一步作人工造病的实验模型.     

禽脑脊髓炎病毒VR株的致病性研究

为探索禽脑脊髓炎病毒强毒VR株对SPF鸡的致病性,开展了不同接种途径和不同日龄SPF鸡的致病力试验。不同接种途径致病力试验结果表明,AEV VR株口服后不能引起发病;刺种、肌肉注射途径接种随着日龄增大,发病率降低;脑内注射途径接种可引起试验鸡全部发病。最小致病量试验结果显示,VR株脑内注射攻毒的最小致病量为10~(2.0) EID_(50)。不同日龄SPF鸡的致病力试验结果表明,随着试验鸡日龄的增大,其致病力略有差异,日龄越小,发病率越高。结果表明,AEV VR株脑内攻毒70日龄内SPF鸡的发病率为80%及以上,攻毒剂量为10~(4.0)EID_(50)。     

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示：(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21～70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊...     

不同接种途径对禽腺病毒在鸡胚中增殖的影响

为评价不同接种途径对禽腺病毒(FAdV)在鸡胚中的增殖能力及病毒的主要分布组织,本研究将FAdV分别采用卵黄囊、尿囊膜和尿囊腔3种途径接种SPF鸡胚,利用荧光定量PCR方法对FAdV在鸡胚组织中的病毒载量进行测定。结果显示,FAdV在鸡胚各组织中均有不同程度增殖。FAdV经卵黄囊途径和尿囊腔途径接种SPF鸡胚,病毒主要嗜性组织为肝脏,经尿囊膜途径接种FAdV,病毒主要嗜性组织为尿囊膜。经卵黄囊途径接种,FAdV在肝脏、尿囊膜和尿囊液中的病毒载量分别为1.38×108拷贝/mg、2.78×107拷贝/mg及1.32×104拷贝/mg。经尿囊膜途径接种,FAdV在肝脏、尿囊膜和尿囊液中的病毒载量分别为1.83×104拷贝/mg、1.08×105拷贝/mg及4.53×104拷贝/mg。经尿囊腔途径接种,FAdV在肝脏、尿囊膜和尿囊液中的病毒载量分别为1.65×105拷贝/mg、7.08×104拷贝/mg及1.26×104拷贝/mg。以上结果表明,不同接种途径对FAdV在SPF鸡胚中的增殖影响较大,其中经卵黄囊途径接种SPF鸡胚,FAdV增殖能力最强。     

经鸡胚感染的ALV-J对新城疫弱毒疫苗免疫的抑制作用及疫苗株对病毒载量的影响

为了解经鸡胚感染携带J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的雏鸡体内ALV-J对新城疫(ND)弱毒疫苗(La Sota株)免疫的抑制作用以及疫苗免疫后增强ALV-J对雏鸡致病作用的可能性,随机选择50个SPF鸡胚经卵黄囊接种模拟ALV-J感染,同时选取等量SPF鸡胚以相同方式接种PBS作为对照。出雏后于接毒组和对照组各取20只SPF鸡在7日龄时免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)。2～6周龄时,记录各组鸡的体重和免疫器官指数,并对雏鸡的NDV抗体水平和血液ALV-J病毒载量进行动态检测。结果显示,感染ALV-J的SPF鸡5、6周龄时体重显著低于PBS对照组(P0.05),而感染ALV-J再免疫新城疫弱毒疫苗后SPF鸡体重进一步降低(P0.05);与PBS对照组相比,6周龄时感染ALV-J的SPF雏鸡胸腺萎缩和脾脏肿大(P0.05),免疫新城疫弱毒疫苗后胸腺和脾脏损伤加剧(P0.05);3、4周龄时感染ALV-J再免疫ND弱毒疫苗组的雏鸡NDV抗体水平极显著低于仅免疫ND弱毒疫苗组(P0.01);4周龄时免疫弱毒疫苗后的SPF鸡血液中ALV-J病毒载量高于未免疫组(P0.01)。研究表明,感染ALV-J的雏鸡在免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)后增强了ALV-J对SPF雏鸡的致病作用,提示净化种源的重要性。     

肉鸡病毒性关节炎的诊断与防制

1病原 肉鸡病毒性关节炎是由呼肠孤病毒引起的传染病。病原为禽呼肠孤病毒,病毒可接种于鸡胚进行培养,病变的腱鞘经常规处理后经卵黄囊接种于5-7日龄的鸡胚,经5-6天后鸡胚死亡,胚体充血和出血,绒毛尿囊膜混浊,脾脏肿大,心肌有坏死灶。绒毛尿囊膜接种病毒时在其绒毛尿囊膜上形成大小不等隆起的疱斑。1日龄肉用雏鸡足垫内接种,第二天即可引起局部红肿等典型的病毒性关节炎。     

禽脑脊髓炎病毒的分离与初步鉴定研究

通过SPF鸡胚连续快速传代，从自然发病雏鸡脑组织中分离出一株食脑脊髓炎病毒（AEV），经鸡胚接种，雏鸡接种、琼脂扩散试验和电镜观察，初步鉴定该株病毒为AEV，暂命名为AEV-SD961株。     

AE油佐剂灭活疫苗对鸡胚和仔鸡保护力的试验

用三批AE（Avian Encephalomyebius)油佐剂灭活疫苗免疫开产前种鸡，免疫后定期采集种蛋进行孵化，当孵至6日龄时取部分鸡胚，卵黄囊途径接种AEVVR株，进行AE鸡胚易感性试验，剩余鸡胚孵化至出雏后，分别于1，7，14，21日龄肌肉途径攻击AEV VR株，攻毒后观察不同日龄仔代雏鸡AE的保护能力。结果疫苗免疫后2-3个月的种鸡所产种蛋的AE鸡胚易感性试验的保护率达100%，而同期所产种蛋孵出的子代雏鸡，在出雏后3周内对AEVVR株攻毒的保护率亦达100%，免疫后6-7个月种鸡所产种蛋的AEVVR鸡胚易感性试验的保护率达75%-80%，而同期所产种蛋孵 出的子代雏鸡，在出雏后3周内对AEVVR株攻毒的保护率达70%-90%，试验结果表明，AE鸡胚易感性试验的鸡胚保护率与同期雏鸡对AEV VR肌肉途径攻毒的保护率基本相同。     

禽副粘病毒2型标准株和国内分离株的透射电镜及免疫电镜观察

将禽副粘病毒2型的标准毒株Yucaipa病毒和国内分离株F4、F6和F8株分别接种SPF鸡胚，收获鸡胚尿囊液；经差速离心和蔗糖密度梯度离心后，分别制备电镜样品和免疫电镜样品；经10g/L醋酸双氧铀负染后电镜观察病毒粒子形态。电镜下病毒粒子大小差别较大，形态呈圆形成椭圆型，直径150－300nm，有结构致密的基质蛋白膜，有的囊膜外可见纤突。免疫电镜样品中毒病明显集中，便于观察。     

禽脑脊髓炎油乳剂灭活疫苗安全性检验及免疫保护性试验研究

该试验采用6日龄鸡胚、2日龄商品肉雏鸡和7日龄SPF雏鸡,分别进行了禽脑脊髓炎油乳剂灭活苗的鸡胚卵黄囊接种及雏鸡脑内和皮下接种试验,通过病理检验检测了疫苗的安全性,同时利用琼扩试验进行了疫苗的免疫效应性检测,利用攻毒试验进行了免疫保护性试验.结果表明,禽脑脊髓炎油乳剂灭活苗具有可靠的安全性和良好的免疫保护性,其琼扩效价可达1∶32.     

一例鸡传染性囊病的诊断及病毒分离鉴定

为获得目前引起传染性囊病的病毒对2017年5月山东青岛某蛋鸡养殖场疑似感染传染性囊病的病例进行了诊断和病毒分离。采用琼脂糖免疫扩散试验诊断该病;SPF鸡胚培养、动物接种分离培养病毒,用RT-PCR和琼扩试验鉴定鸡胚分离病毒。结果在琼脂糖免疫扩散试验中该病毒能与传染性囊病阳性血清呈现白色沉淀线;在SPF鸡胚接毒后第3~4天出现鸡胚死亡现象,且胚体皮下出血、绒毛尿囊膜增厚混浊等特征;RT-PCR反应中该抗原能利用特异性引物扩增出目的片段;对30日龄SPF鸡攻毒试验中出现腔上囊肿大,黏膜面有点状出血等病变。结果表明,在实验室确诊了传染性囊病并在鸡胚中成功增殖了该病毒。     

HVT国内株的分离鉴定

用来自国内某火鸡饲养场的健康火鸡血白细胞 ,接种于鸡胚成纤维细胞 ,分离到一株火鸡疱疹病毒的野毒—SY8_2。电镜下可观察到分离株SY8_2的鸡胚成纤维细胞培养物中存在典型的火鸡疱疹病毒粒子 ;分离株SY8_2的细胞培养物经卵黄囊途径接种 4日龄鸡胚 ,14天后在绒毛尿囊膜上形成痘斑 ;用分离物SY8_2细胞培养物接种 1日龄SPF雏鸡 ,感染雏鸡可产生病毒血症 ,并能从感染雏鸡的血液白细胞中重新分离到病毒 ;经 2个月的临床观察人工感染鸡无不良反应 ,剖检无任何病理解剖学变化 ;用HVT特异性单克隆抗体L78(3型 )做间接免疫荧光染色试验证实分离株SY8_2为MD血清 3型病毒—HVT。