鲤鱼三、四核苷酸重复微卫星座位的筛选及特征分析*

采用磁珠富集法结合放射性同位素杂交法分离出鲤鱼(Cyprinus carpio)三、四核苷酸重复的微卫星阳性克隆1248个。对其中的384个克隆进行测序分析,共得到微卫星序列325个,其中完美型244个（75.08%）,非完美型59个（18.15%）,混合型22个（6.77%）。依据得到的微卫星序列,用Primer 3软件在线设计并合成引物145对,检测结果显示71.43%（80对/112对）的引物在野生个体间表现出多态性,等位基因数在3~12之间,多态信息含量在0.2109~0.8607之间,80%的位点处于高度多态水平。对群体的遗传结构评估结果显示,四核苷酸重复的微卫星标记在黑龙江鲤野生群体表现出的多态性水平（PIC=0.7740）高于三核苷酸重复（PIC=0.5161）和双核苷酸重复（PIC=0.49）,适用于群体间遗传差异分析和遗传连锁图谱的构建。     

鳜原种群体和养殖群体遗传多样性的微卫星分析

本研究利用20对微卫星引物对鳜（Sinipelrca chuatsi）原种群体和养殖群体进行遗传多样性分析。结果表明,在鳜原种群体中检测到多态性位点14个,养殖群体11个。在两个群体中共检测到等位基因数96个,其中原种群体检测到等位基因数53个,每个位点的等位基因数在1～7之间,平均有效等位基因数为2．7390;养殖群体检测到等位基因数43个,每个位点的等位基因数在1-6之间,平均有效等位基因数为2．1284。原种群体的平均观察杂合度0．5708,Nei氏期望杂合度0．5295,平均多态信息含量PIC0．5353;养殖群体的平均观察杂合度0．3839,Nei氏期望杂合度0．4011,平均多态信息含量PIC0．5043。因此,与养殖群体相比,鳜原种群体仍有丰富的遗传多样性。本研究可为鳜种质资源的保护、监测和遗传育种提供分子水平上的数据。     

鲮微卫星DNA分子标记的筛选与遗传多样性分析

采用磁珠富集法对已建立的生长较快的西江段野生浅色鲮群体的极大、极小群体各31尾基因组DNA进行了微卫星序列的筛选,128个阳性克隆成功测序93个,其中80个为的微卫星序列,微卫星序列完美型占85％,非完美型占6．25％,混合型占8．75％。利用微卫星序列合成了23对微卫星引物,扩增结果表明,等位基因数为1～10个,扩增片段大小为92～283bp,其中14对引物扩增条带清晰,为中度或高度多态位点,极大、极小群体的平均有效等位基因数和平均多态信息含量分别为3．0784、3．2079和0．5675、0．5974,反映出2个群体遗传多样性均较丰富;高度多态性引物4的位点b,片段大小为119bp,在极大群体中出现频率为61．3％,在极小群体占22．6％,出现频率极大群体高于极小群体近3倍,初步可作为候选差异性分子标记。     

江西青岚湖五种淡水蚌遗传多样性的微卫星DNA分析

利用北美Epioblasma capsaeformis（蚌科）和中欧Margaritifera margaritifera L.（珍珠蚌科）两种淡水双壳类的20对微卫星引物对江西青岚湖五种淡水蚌群体进行了PCR扩增，筛选出8对多态性较高的引物，并用这8个微卫星座位分别对三角帆蚌、褶纹冠蚌、洞穴丽蚌、射线裂脊蚌和中国尖嵴蚌五种蚌类群体进行了遗传多样性分析。结果表明：不同蚌类群体的平均等位基因数为2.8750～4.000，平均观测杂合度（HO）为0.4417～0.6333，平均期望杂合度（HE）为0.4430～0.5706，平均多态信息含量（PIC）为0.368～0.498，五个群体表现出较高的遗传多样性。有多个座位在不同蚌类群体中偏离哈代－温伯格平衡。五种蚌类群体间的遗传距离在0.6228与1.4724之间，三角帆蚌和褶纹冠蚌之间的遗传距离最大，射线裂脊蚌和洞穴丽蚌之间的遗传距离最小。     

微卫星标记分析广西水牛遗传多样性

为研究广西沼泽型水牛(Bubalus bubalis)核基因组的多态性,采用23对荧光标记微卫星引物,对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR检测。结果表明,23对引物中,有19对可以获得特异性产物且存在多态,平均有效等位基因数为4.0189,基因座ILSTS086含有13个等位基因;各微卫星基因座的平均杂合度变化范围为0.1852~0.4722,ILSTS019基因座平均杂合度最高(0.4722),而ILSTS017平均杂合度最低(0.1852);群体基因平均多态信息含量(PIC)为0.6639,19个标记中有18个PIC大于0.5,属高度多态位点。     

黄颡鱼微卫星标记筛选及特征分析

通过磁珠富集法首次筛选黄颡鱼微卫星标记并对其特征进行分析。用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7进行微卫星片断的富集,挑选部分阳性克隆测序获得38个含有微卫星的DNA序列,总计设计并合成了22对微卫星引物。以普通黄颡鱼基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记,每对引物等位基因数2-8个（平均3.78）,遗传杂合度0.2225-0.8101（平均0.5755）,多态信息含量0.3425-0.7900（平均0.5336）。此外18对多态性微卫星引物中有16对在黄颡鱼属其它4种鱼类具有通用性,13对在鲇形目中的3种鱼类具有通用性。因此,可以推断筛选的多态性微卫星标记可用于黄颡鱼属和鲇形目鱼类的遗传分析。     

致病疫霉基因组微卫星标记开发

致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是影响马铃薯生产的第一大真菌病害.通过致病疫霉基因组开发微卫星标记,旨为致病疫霉群体遗传结构研究提供更系统、有效的标记.利用软件SciRoKo和ClustalX对致病疫霉基因组中微卫星序列长度≥25 bp的适合标记开发的位点及两端序列进行筛选.然后在这些位点的两端序列上设计专一性PCR扩增引物,选择9株致病疫霉菌对引物的专一性和微卫星的多态性进行检测.最后利用40株不同年份和地理来源的致病疫霉菌株对可行性微卫星标记进行等位基因数的确定及其多态性评估,然后选取部分标记对40株致病疫霉群体进行遗传多样性分析.共获得了33个具多态性的微卫星标记,占开发总数的28.7％,其多态信息含量(PIC)值都在0.164～0.614之间,其中PIC≥0.5的标记有7个,0.25 ＜PIC＜0.5的标记有25个,PIC≤0.25的有1个.发现致病疫霉微卫星基因型与其交配型及地理来源有一定相关性,与甲霜灵敏感性不相关.本研究开发出一批具有多态性微卫星标记,为致病疫霉群体遗传学研究机理提供更多多态性高,稳定性强的分子标记.     

用EST-SSR标记对我国养殖斑点叉尾鮰种质资源的研究

本实验采用EST-SSRs分子遗传标记技术对福州和湖北嘉鱼县的1984年群体（P1984）、福州与辽宁辽中县的1997年群体（P1997）、湖南的2004年群体（P2004）和福州的1984年与1997年群体杂交的F1代群体（P8497)等4个斑点叉尾鮰养殖群体的遗传多样性进行研究。斑点叉尾鮰EST-SSRs是从斑点叉尾鮰ESTs 序列（表达序列标签）中开发的一种新型SSR 标记,这种新型分子标记来源于表达基因,将其用于斑点叉尾鮰遗传研究可直接反映相关基因在不同斑点叉尾鮰群体间的表达差异。本实验检测到两个功能明确的基因位点。实验结果表明有10对引物可扩增出清晰条带,其中9对引物具有多态性,可作为斑点叉尾鮰遗传标记分析,有效的多态性引物占90%,共获得32个等位基因,其中大多数引物有2～4 个等位基因,4个群体的平均等位基因数（A）为3.0000-3.4000, 平均有效等位基因数（ae）为1.9455-2.3024,平均观察杂合度（Ho）为0.4068-0.4732,平均期望杂合度（He）为0.4148-0.4907,平均多态信息含量（PIC）为0.4113-0.4829,群体间的多态性差异不显著,且各群体的遗传多样性处于中等水平。根据群体间遗传相似性系数、遗传距离及UPGMA聚类分析发现,P1997和P2004群体之间的遗传距离最近,P1984和P2004群体之间的遗传距离最远,这验证了四个群体的引入顺序。通过Hardy—Weinberg检验发现,4个群体有18.75％的位点偏离了Hardy—Weinberg平衡, 表明群体各位点的基因频率和基因型频率稳定性较好。通过F-检验发现,P2004和P8497处于不同程度的杂合子过剩状态,P1984和P1997处于杂合子缺失状态。群体间发生分化程度很弱,遗传变异主要来自群体内个体之间。     

利用RAPD与SSR技术进行野生大豆种群内分化的研究

利用RAPD和SSR技术对25°N野生大豆种群16个样本进行分子标记,从150多个RAPD引物中筛选出具有多态性的引物20个,共扩增出146个标记位点,其中具有多态性的有60个,占总位点的40.8%,平均遗传距离为0.1536,杂合度为0.3248.从60对SSR引物中筛选出14对具有多态性的引物,平均遗传距离为0.2209,杂合度为0.6961.聚类分析可将25°N野生大豆16个样本分成5类,表明种群内存在大量的遗传变异.为研究野生大豆种群内及种群间的遗传多态性探索了有效方法,并提出野生大豆核心种质资源的保存及取样对策.     

华南鲤选育品种与地方品种的遗传多样性比较分析

华南鲤(Cyprinus carpio rubrofuscus)作为优质的地方鲤鱼品种禾花鲤在广东省粤北地区有着悠久的稻田养殖历史。为了解人工养殖和选育对华南鲤群体的遗传多样性和遗传结构的影响,为华南鲤的种质资源保存和育种利用等提供依据,本研究采用16对微卫星引物对华南鲤第5代选育群体(F5)和2个地方品种(乳源群体,乐昌群体)的遗传多样性进行了比较分析。结果显示,在3个群体中,16对微卫星引物均表现为多态性,共扩增得到119个等位基因,每个微卫星座位检测到的等位基因数为3~10个,平均每对引物7.44个。3个群体的平均期望杂合度(He)分别为0.636 0、0.698 9和0.775 1,Shannon多样性指数(I)分别为1.206 3、1.402 0和1.612 2,平均多态信息含量(PIC)分别为0.570 1、0.645 8和0.720 7,表明3个群体都具有较高的遗传多态性(PIC0.5000),但地方品种的遗传多样性水平高于选育品种。3个群体各个微卫星位点上的遗传分化指数(Fst)值介于0.044 0~0.246 8,平均值为0.102 8,表明群体间的遗传变异水平中等。群体间遗传分化指数(Fst)配对比较结果显示,选育群体F5与乐昌群体的遗传分化指数值最大(0.182),乳源群体和乐昌群体2个地方群体间则最小(0.058)。实验结果表明,人工选育加快了华南鲤选育品种与地方品种的遗传分化,也导致了选育品种遗传多样性下降,但选育品种遗传多样性水平依然较高,还具有进一步选育的潜力。本研究结果为下一步制定华南鲤新品种选育计划提供基础遗传数据。     

核桃EST-SSR标记的开发

从GenBank数据库上公布的5025条核桃（Juglans regia）EST序列中,用SSRHunter软件搜索到485条EST序列中含有540个SSR,SSR出现频率为10.75%,SSR-ESTs检出率为9.7%。利用检出的SSR-ESTs序列设计SSR引物43对,对6个核桃样品、1个黑核桃（J. nigra）样品和1个核桃楸（J. mandshurica）样品进行了PCR扩增,其中40对引物有扩增带,占设计引物的93%,35对引物有多态性,占可扩增引物的87.5%。在有多态性的35对引物中,27对引物在核桃种内有多态性;8对引物在核桃种内无多态性,而在核桃、核桃楸和黑核桃种间有多态性。应用UPGMA方法对检测样品进行聚类分析,结果与传统分类一致。     

白孔雀微卫星DNA遗传多样性分析及其分类地位的探讨

利用14对蓝孔雀和绿孔雀的微卫星标记对白孔雀基因组DNA进行扩增,发现都能扩增出特异性条带,每对引物扩增的平均等位基因数为1.71,有7对引物具有较丰富的多态性,其中MCW0080和MCW0098最为理想。白孔雀与蓝孔雀和绿孔雀群体的遗传多样性分析结果表明,白孔雀、绿孔雀和蓝孔雀3个群体的杂合度和遗传多样性水平都很低,期望杂合度分别为0.2579、0.2482和0.2744,群体间的遗传分化系数为9.7%,群体间分化极显著(P<0.001),白孔雀与蓝孔雀的亲缘关系最近, Reynolds'遗传距离和基因流分别为0.0295和8.6112。本试验结果支持白孔雀不能成为蓝孔雀的一个亚种而只是一个品系的观点。     

白孔雀微卫星DNA遗传多样性及其分类地位

利用14对蓝孔雀(Pavo cristatus)和绿孔雀(P.muticus)的微卫星标记对白孔雀基因组DNA进行扩增,发现都能扩增出特异性条带,每对引物扩增的平均等位基因数为1.71,有7对引物具有较丰富的多态性,其中MCW0080和MCW0098标记期望杂合度分别为0.7207和0.7571,多态信息含量分别为0.658和0.695,表现出丰富的遗传多样性和较高的选择潜力。白孔雀×蓝孔雀和绿孔雀群体的遗传多样性分析结果表明,白孔雀、绿孔雀和蓝孔雀3个群体的杂合度和遗传多样性水平都很低,期望杂合度分别为0.2579、0.2482和0.2744,群体间的遗传分化系数为9.7%,群体间分化极显著(P<0.001),白孔雀与蓝孔雀的亲缘关系最近,Reynolds'遗传距离和基因流分别为0.0295和8.6112,表明白孔雀不是蓝孔雀一个亚种。     

四个鲤鱼种群遗传多样性的AFLP分析

本文采用AFLP技术对黑龙江野鲤、黄河鲤、建鲤和荷包红鲤4个鲤鱼种群共96个个体进行了遗传多样性分析。结果显示,8对选择性扩增引物共扩增得到502个位点,其中多态性位点273个,多态性比率为54．38％。同时对4个种群的Shannon多样性指数,Nei’s基因多样性等参数进行了分析,结果表明,4个种群的Shannon多样性指数分别为0．2114±0．2705,0．1825±0．2694,0．1888±0．2587和0．1600±0．2426,Nei’s基因多样性指数分别为0．1398±0．1872,0．1225±0．1863,0．1235±0．1774和0．1036±0．1636;总基因多样性（H4）平均值为0．1721±0．0350;种群内基因多样性（Hs）平均值为0．1224±0．0190;基因分化系数（Gst）为0．2892,种群内的基因多样性占总群体的71．08％,种群间为28．92％,而基因流系数（Nm）为1．2291。另一方面,分子方差分析（AMOVA）结果表明,种群平均近交系数（Fst）为0-31191,变异31．19％来自种群间,68．81％来自种群内。4个种群中黑龙江野鲤的种内多态性比例最高,而荷包红鲤种群最低,并且4个鲤鱼种群当前的种质资源良好,具有一定的种群稳定性;建鲤已经开始分化,与亲本荷包红鲤亲缘关系逐渐分化,逐步形成自己稳定的遗传结构。本研究为探讨鲤鱼种群的遗传特性和遗传分化提供参考,也为其种质资源的保护及合理利用提供科学依据。     

中华鳖5个群体遗传多样性的微卫星分析

利用微卫星分子标记技术对洞庭（DT）、黄河（HH）、黄沙（HS）、日本（RB）以及洞庭（DT）与黄河（HH）的杂交子代（DT♀×HH♂）绿卡（LK）5个中华鳖群体的150个个体进行遗传多样性分析。11对微卫星引物扩增出的等位基因数为3～6个,平均等位基因数为4.1818。5个种群相比,绿卡（LK）的平均有效等位基因数、平均期望杂合度、平均观测杂合度和平均多态信息含量最高,分别是2.3969、0.5274、0.5545和0.4660。对种群间的遗传分化分析表明,黄河（HH）和洞庭（DT）之间的遗传分化最小,为0.0233,而洞庭（DT）和日本（RB）之间的遗传分化最大,为0.0969。基于Nei＇s遗传距离构建的UPGMA系统进化树显示黄河（HH）和洞庭（DT）及其子代绿卡（LK）亲缘关系较近,而与黄沙（HS）和日本（RB）的亲缘关系较远,最远的为日本（RB）群体。     

Isolation of novel microsatellite loci in Orchesella villosa (Arthropoda, Collembola)

An experimental procedure using biotin-labelled probes and streptavidin-bound magnetic beads (FIASCO) was used to produce a microsatellite-enriched library for the collembolan Orchesella villosa. PCR primers were successfully constructed for seven loci containing, respectively, five pure, one interrupted, and one compound dinucleotide microsatellite repeats. As a preliminary test of their variability, we investigated 15 individuals from 5 locations inside a dismissed mining area in southern Tuscany. All microsatellite loci showed high levels of polymorphism. The mean number of different alleles at each locus across populations was 10.1 and observed heterozygosity per locus was 0.13–0.86. Only 2 out of the 7 loci appeared to be in Hardy–Weinberg equilibrium. The potential application of these loci to test the effects of environmental contamination on the genetic structure of exposed populations is discussed.     

Exploitation of <Emphasis Type="Italic">Malus</Emphasis> EST-SSRs and the utility in evaluation of genetic diversity in <Emphasis Type="Italic">Malus</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Pyrus</Emphasis>

A total of 8117 suitable SSR-contaning ESTs were acquired by screening from a Malus EST database, among which dinudeotide SSRs were the most abundant repeat motif, within which, CT/TC followed by AG/GA were predominant. Based on the suitable sequences, we developed 147 SSR primer pairs, of which 94 pairs gave amplifications within the expected size range while 65 pairs were found to be polymorphic after a preliminary test. Eighteen primer pairs selected randomly were further used to assess genetic relationship among 20 Malus species or cultivars. As a result, these primers displayed high level of polymorphism with a mean of 6.94 alleles per locus and UPGMA cluster analysis grouped twenty Malus accessions into five groups at the similarity level of 0.6800 that were largely congruent to the traditional taxonomy. Subsequently, all of the 94 primer pairs were tested on four accessions of Pyrus to evaluate the transferability of the markers, and 40 of 72 functional SSRs produced polymorphic amplicons from which 8 SSR loci selected randomly were employed to analyze genetic diversity and relationship among a collection of Pyrus. The 8 primer pairs produced expected bands with the similar size in apples with an average of 7.375 alleles per locus. The observed heterozygosity of different loci ranged from 0.29 (MES₉₆) to 0.83 (MES₁₃₈), with a mean of 0.55 which is lower than 0.63 reported in genome-derived SSR marker analysis in Pyrus. The UPGMA dendrogram was similar to the previous results obtained by using RAPD and AFLP markers. Our results showed that these EST-SSR markers displayed reliable amplification and considerable polymorphism in both Malus and Pyrus, and will contribute to the knowledge of genetic study of Malus and genetically closed genera.