采用AFLP技术分析稻曲病菌的遗传多样性Ⅰ:同一块稻田中稻曲病菌的遗传结构

 采用AFLP (Amplified fragment length polymorphism)技术分析了来自北京昌平同一块稻田中不同水稻品种和育种中间材料上稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)的遗传多样性。从256对EcoRⅠ和MseⅠ引物中选择30对扩增40个菌株。结果表明,同一块稻田中稻曲病菌菌株间的相似性系数达0.72以上,来自同一小区的多数菌株能聚成亚类;发现从同一水稻品种分离的菌株没有特异性的AFLP谱带。初步推断稻曲病菌与水稻品种不存在明显的专化性互作。     

稻曲病菌致病机制研究进展

 稻曲病是一种水稻穗部病害,在世界各水稻主产区均有发生,已成为世界性病害,在我国也属于水稻主要病害之一。稻曲病的发生严重影响水稻产量和稻米品质。研究其病原菌致病机制,对找寻防治药物的特异性靶标具有重要作用,可为抗病分子育种提供新的思路,为稻曲病菌防治药剂研发提供新的靶标。本文综述了稻曲病菌侵染过程、致病相关基因功能研究、水稻响应稻曲病菌侵染等方面的研究进展,提出进一步研究的策略。现有研究表明,稻曲病菌能成功侵染水稻孕穗期雄蕊的花丝引起发病。病原菌可通过抑制多个水稻免疫途径实现成功侵染;还可模仿胚珠受精激活水稻灌浆、糖代谢等途径为稻曲球的形成提供营养物质;全基因组测序完成和基因编辑技术在基因敲除中的成功应用,为稻曲病菌功能基因研究提供了很好的基础。稻曲病菌独特的侵染过程和营养利用机制是未来研究的重要方向。     

稻曲病菌致病机制研究进展

 稻曲病是一种水稻穗部病害,在世界各水稻主产区均有发生,已成为世界性病害,在我国也属于水稻主要病害之一。稻曲病的发生严重影响水稻产量和稻米品质。研究其病原菌致病机制,对找寻防治药物的特异性靶标具有重要作用,可为抗病分子育种提供新的思路,为稻曲病菌防治药剂研发提供新的靶标。本文综述了稻曲病菌侵染过程、致病相关基因功能研究、水稻响应稻曲病菌侵染等方面的研究进展,提出进一步研究的策略。现有研究表明,稻曲病菌能成功侵染水稻孕穗期雄蕊的花丝引起发病。病原菌可通过抑制多个水稻免疫途径实现成功侵染;还可模仿胚珠受精激活水稻灌浆、糖代谢等途径为稻曲球的形成提供营养物质;全基因组测序完成和基因编辑技术在基因敲除中的成功应用,为稻曲病菌功能基因研究提供了很好的基础。稻曲病菌独特的侵染过程和营养利用机制是未来研究的重要方向。     

中国部分地区稻曲病菌培养特性及其遗传多样性分析

采用生物学方法和RAPD-PCR技术,对来自11个省(市)84个菌株的菌丝生长速率、分生孢子数量、孢子萌发率及其遗传多样性进行分析,以明确中国部分地区稻曲病菌株的培养特性和遗传多样性。依据菌丝生长速率,菌株可被划分为快和慢2种类型,分别占58.33%和41.67%。依据产孢力和分生孢子萌发力,菌株可划分为强、中和弱3种类型。采用12条RAPD引物共扩增出323条带,多态性条带比率为98.14%,遗传距离变化范围为0.02～1.00。在遗传距离0.725水平上,所有菌株被划分成7个遗传聚类组,聚类组R4和R5为优势聚类组,并存在一些亚组。不同地区之间和同一地区内的菌株表现出不同程度的变异,内陆地区的菌株群体变异程度明显高于沿海地区。从采用相同接种体接种的水稻品种上分离的稻曲病菌具有紧密的亲缘关系。     

辽宁省稻曲病菌遗传多样性和致病力分析

为有效防治辽宁省稻曲病菌Ustilaginoidea virens,利用重复序列PCR(repetitive elementbased PCR,rep-PCR)分子指纹技术,对2017年自辽宁省8个市8个主产稻区采集的51株稻曲病菌菌株进行遗传多样性和致病力分析。结果显示,在3对引物中,以BOX1/BOX2和ERIC1/ERIC2为引物扩增的DNA指纹图谱的遗传多样性值分别为0.764、0.707,均大于0.7,故选择这2种引物扩增的DNA指纹图谱进行遗传多样性分析;当DNA指纹相似系数为0.78时,以BOX1/BOX2为引物和以ERIC1/ERIC2为引物扩增的DNA指纹图谱分别将供试菌株划分为12个和10个遗传类群;供试菌株致病力可划分为弱致病型、中等致病型和强致病型3个致病型,所占比例分别为33.33%、58.82%和7.85%,强致病型菌株仅在沈阳市、鞍山市和大连市出现;所有优势类群均包含3种致病型菌株。表明辽宁省稻曲病菌遗传结构复杂,不同地理来源的稻曲病菌菌株致病力存在一定差异,相同致病型的稻曲病菌菌株分属于不同的遗传类群,同一遗传类群中包含不同的致病型菌株。     

水稻稻曲病室内人工接种技术

为提高稻曲病人工接种的发病效果和稳定性,在温棚条件下采用水稻孕穗期注射接种法分别研究了稻曲病菌不同接种体、培养时间、接种浓度和接种时期的接种效果。采用病菌马铃薯蔗糖液体培养基（potato sucrose broth,PSB）作为接种体,其穗发病率为100%,明显好于病菌米糠培养液（23.33%）。病菌在PSB中培养5～7天接种效果较好,随病菌培养天数的延长,接种效果明显下降。接种的分生孢子浓度越低水稻病穗率和病粒数也越低。在水稻品种两优培九孕穗中后期,采用含分生孢子浓度为4×106个/mL的病菌PSB培养液注射接种,穗发病率达100%,平均病粒数35.1粒,最高达87粒。研究表明,温棚条件下建立的稻曲病人工接种技术能获得稳定的发病效果,并可区别水稻品种间的抗性差异。     

稻曲病侵染时期和流行因素研究

分期接种试验的结果表明,稻曲病对水稻的侵染时期,主要在孕穗末期至破口期,病菌侵入籽粒在水稻开花前。3a的系统调查和对比分析结果说明,水稻穗期最高气温>32℃的天数少,降雨量大,有利病菌的侵入和发展流行,品种间抗(耐)病性差异显著。近年来稻曲病发生严重的主要原因是单季晚稻的大面积种植,穗期气候条件适宜病害发生流行。     

籼型杂交水稻对稻曲病的田间抗性差异

为了解不同水稻品种在田间的抗性差异及其与农艺性状的相互关系,在相同的土壤环境和栽培条件下,利用稻曲病菌诱发接种鉴定,对56个籼型杂交水稻进行田间抗性差异比较,初步探讨了抽穗期和农艺性状与品种田间抗性的关系.结果表明,不同水稻品种对稻曲病田间抗性存在显著差异,病穗率为0.43%～33.04%,病情指数为0.05～16.14;不同抽穗期的品种稻曲病发病率不同,同一抽穗期的品种对稻曲病的抗性亦表现出明显差异;水稻株高与品种抗性之间呈正相关,相关系数为026(P<0.05);水稻分蘖率、有效穗数、剑叶性状等与品种的田间抗性有一定相关性,但差异不显著(P>0.05);水稻株叶形态和叶色与品种田间抗性没有直接相关性.     

四川省籼稻区水稻稻曲病菌遗传多样性分析

应用ERIC-PCR指纹技术,对采自四川省6个籼稻自然生态区的60个稻曲病菌菌株进行了DNA分子水平上的遗传多样性研究,并进行UPGMA聚类分析和相似性分析.结果表明,所采用的ERIC引物在不同供试菌株中分别扩增出5～20条不等的带谱;在0.75相似水平上,供试菌株被划分为11个遗传型群,其中L1、L4、L5为优势群,并存在次要小型群和特异性型群;来自同一地区的稻曲病菌菌株具有较高的遗传相似性,而不同地区的稻曲病菌则表现出程度不同的变异,且寄主品种与稻曲病菌遗传差异之间的相关性较小.     

稻曲病菌bZIP转录因子UvbZIP12的功能研究

 稻曲病是由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)侵染水稻穗部引起的真菌病害,严重影响稻米的产量和品质。bZIP转录因子参与多种植物病原菌的生长发育和致病过程。稻曲病菌中有28个bZIP转录因子,但其具体功能尚未被研究。本研究对bZIP转录因子UvbZIP12在稻曲病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析。稻曲病菌接种水稻后,UvbZIP12基因表达量逐渐升高,在接种后3 d和5 d时具有最高表达量。对UvbZIP12基因的敲除转化子分析发现,敲除转化子ΔUvbZIP12在PSA、PDA、YTD培养基上生长速率显著加快,菌丝干重显著增加;产孢量减少;对NaCl和sorbitol的耐受性增强,对SDS、CR、CFW和H₂O₂的耐受性减弱;对水稻的致病力无明显变化。结果表明,稻曲病菌UvbZIP12参与调控生长发育和对非生物胁迫的耐受性,但不参与致病。     

稻曲病产量损失测定及调查测报因子研究

稻曲病是水稻穗部的重要真菌性病害。本研究分析了13个供试水稻品种每穗稻曲病病粒数与水稻产量损失的线性关系,根据每个品种线性方程及南方稻区实际情况,得出了田间稻曲病经济允许水平、成灾因子,即平均每穗病粒数分别为0.57、5.44粒。     

不同栽培方式对稻曲病发生程度的影响

2008年和2009年连续两年在辽宁省东港市稻区利用3个感稻曲病品种进行田间水稻不同栽培方式对稻曲病发生程度的影响试验。不同施肥方式试验结果表明:单位面积总氮肥量越大,稻曲病发生越重。在施肥总量相同的情况下,在水稻生长后期(穗肥)氮肥量增大有利稻曲病发生。不同播期、插秧期试验表明在试验条件下水稻播期、插秧期偏后,稻曲病发生有加重的趋势。不同插秧密度试验结果显示,水稻插秧密度越大,稻曲病发生相对越重。     

水稻品种生育期、田块和播种期对稻曲病发生严重度的影响

利用早熟组和晚熟组各8个水稻品种采用随机区组设计连续进行两年田间试验,分析生育期与稻曲病严重度的关系,同时采用晚熟组5个品种分析田间厚垣孢子数量、播期与稻曲病发生严重度的关系。结果表明,水稻生育期、田间菌量与稻曲病田间发生的严重度呈显著正相关。早熟组各水稻品种的发病率均显著低于晚熟组各水稻品种,2005年晚熟组和早熟组品种的病穴率、病穗率和病粒率分别为76.3%、26.6%、4.6%和5.4%、0.8%、0.02%,2006年分别为75.7%、29.8%、4.7%和16.8%、3.3%、0.08%。此外,在上一年田间遗落菌量多的田块中各水稻品种稻曲病的发生程度显著高于菌量小的田块。晚熟组水稻品种的发病严重度与播种期无明显的相关性。据此认为,以种植晚熟水稻品种为主的北方稻区,种植早熟品种或进行轮作是防治该病的有效方法。     

稻曲病菌菌核降解微生物的筛选与作用机制分析

菌核是稻曲病菌天然的越冬菌源和来年病害发生的重要初侵染源,控制田间菌核越冬数量能够从源头上遏制和减轻稻曲病的发生。为此,本研究对来自稻田土壤、菌核表面、以及青海高原的能够降解菌核的真菌进行了筛选,得到了6个有较好降解作用的生防菌株。在实验室条件下它们能够在30~70 d内彻底降解稻曲病菌菌核。真菌形态特征和rDNA-ITS序列分析表明,这些菌株分别为淡色生赤壳菌Bionectria ochroleuca、粘鞭霉Gliomastix polychroma、烟曲霉Aspergillus fumigatus、草酸青霉Penicillium oxalicum、粉红粘帚霉Gliocladium spp.和疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria。进一步超微结构观察发现,不同生防菌对菌核的降解机制可分为以重寄生作用和直接降解为主2种基本模式。春季田间撒施试验表明,其中2种生防菌的防治效果可达33.9%和46.8%。     

Genetic, phenotypic and pathogenic diversity of Xanthomonas arboricola pv. corylina strains question the representative nature of the type strain

A collection of 31 Xanthomonas arboricola pv. corylina strains isolated from Corylus maxima and C. avellana of different countries were assessed by means of repetitive PCR using ERIC, BOX and REP primer sets and analysis of whole-cell protein extracts; pathogenicity tests to three hazelnut ( C. avellana ) cultivars; and some key biochemical tests. From these studies, the X. arboricola pv. corylina strains were clustered into five and three groups by repetitive PCR and protein analysis, respectively, and by using UPGMA cluster analysis, with two strains forming an outlier group to these. The groups showed a high degree of similarity. Strain membership between the groups designed by the two methods exhibited a high degree of congruence, and diversity between the groups was low. Surprisingly, the two strains originating from C. maxima , that include the type strain NCPPB 935, formed the most distinctive group. No relationship to geographic origin of the strains was evident. All strains proved pathogenic towards three different hazelnut cultivars, although the strains obtained from C. maxima did not incite any significant symptoms on buds and twigs. No other relationships between rep-PCR and whole-cell protein groups and pathogenicity were evident. The distinctiveness of the C. maxima strains was supported further by atypical negative gelatin liquefaction test and reduced quinate metabolism results.     

水稻稻粒黑粉病病原菌鉴定及致病性测定

为明确我国南方杂交水稻制繁种区稻粒黑粉病病原菌及其致病力情况,于2015年8月从安徽、湖南、江苏、贵州、四川遂宁、四川新津、四川温江7个主要杂交稻制繁种区采集稻粒黑粉病样本,采用冬孢子悬浮液分离法进行病原菌的分离。基于形态学、菌丝细胞核荧光染色和r DNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并应用柯赫氏法则对不同地区病样中分离的纯培养物致病性进行测定。结果表明分离到的35株病原菌菌株并无明显形态学差异,冬孢子呈球形或椭圆形,次生小孢子单细胞核,呈线状或弯曲状两种类型,与已报道的黑粉菌属Tilletia horrida形态特征相似;r DNA-ITS序列分析表明,选取的7株病原菌菌株与T.horrida DQ827699同源性达100%,说明所分离菌株为稻粒黑粉病菌;致病性试验表明,7株病原菌菌株侵染水稻稻粒均能产生稻粒黑粉病的典型症状,其中分离自江苏的菌株JS造成的单穗病粒数和产量损失最大,致病力较强,且萌芽率最高,分离自不同地区的菌株致病力具有明显差异。该7株病原菌最适生长温度为28℃,光照对其生长没有明显影响。     

水稻穗部农艺性状与稻曲病抗性的相关性分析

 人工接种试验和田间多年自然发病调查发现,目前生产上应用的水稻品种均感稻曲病;但在自然条件下,不同水稻品种稻曲病的发生程度存在较大差异,可以人为的分为多病粒高感品种和寡病粒相对抗病的品种。为了探究水稻穗部性状与其病害抗性间的关系,本文对孕穗期不同阶段的不同水稻品种的穗部性状进行了比较分析。结果发现表型为多病粒的高感多病粒品种与表型为寡病粒的相对抗病的品种之间在穗子大小、小花密度、穗鞘闭合程度和密封性、旗叶面积等方面均存在明显差异,寡病粒相对抗病的水稻品种穗鞘闭合程度优于高感多病粒品种。     

Ustilaginoidea virens在自然发病水稻植株体内分布情况的检测

水稻稻曲病(rice false smut)近年来在我国长江中下游地区和东北地区发生趋于严重,已经上升为水稻生产的主要病害之一,但是关于该病害的侵染方式尚存在争议。本研究以稻曲病菌线粒体核酸序列为检测靶标,建立了一套更加简便快速的PCR检测体系,并通过该检测体系对常发病田内30 d秧龄移栽后35 d的苗期水稻植株以及灌浆期发病植株体内稻曲菌的分布情况进行了检测。研究结果表明,所建立的检测体系具有较好的特异性,灵敏度可达到1 pg水平。对移栽后35 d的苗期样品和灌浆期病株不同组织进行检测发现,在苗期水稻的根和叶鞘组织以及灌浆期发病植株的茎组织中,均可检测到稻曲菌。该结果为稻曲病菌在水稻不同发育时期、不同组织内的分布情况提供了直接的分子证据,并为稻曲病侵染过程的进一步研究以及大田防治策略的制定奠定了基础。     

稻曲病的接种技术研究

 探索在田间条件下进行稻曲病的人工接种技术。通过比较3种接种体发现,上年保存于-20℃的厚垣孢子不能引起发病;用PS液体培养获得的薄壁分生孢子可引起发病,孢子浓度越高引起病穗率越高;菌丝片段-分生孢子混合液接种发病最严重。病原菌的培养菌龄对接种效果有影响。在水稻的3个时期接种,以抽穗破口前6~9d的效果最好。在一天的3个时段接种,以下午4~6时的病情最重。在接种液里添加马铃薯煮汁可显著提高接种发病率。本文的接种技术能高效引发稻曲病,最高穗发病率100%,最大病情指数93.96,最多穗病粒数110粒。该接种技术可鉴别出品种抗病性的差异。     

3种防御酶在水稻抗稻曲病中的活性变化

不同水稻品种对稻曲病抗性存在明显差异。本研究选用12个不同抗、感病水稻品种,在抽穗前7~10 d,用注射法接种稻曲病菌分生孢子悬浮液。结果表明,在抗病品种中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）3种酶活性接种后迅速提高,变化幅度较大;而感病品种的酶活性在接种后缓慢增加,变化幅度小。由此说明,这3种防御酶与水稻抗稻曲病有一定的关系。