利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

百脉根根瘤内根瘤菌与假单胞菌的多样性分析

为了探索百脉根根瘤内生菌多样性,揭示百脉根根瘤内根瘤菌与假单胞菌的多样性及其互作关系并寻找能结瘤的根瘤菌,本研究采用免培养和可培养相结合的方法对百脉根根瘤内生菌的多样性进行分析,采用平板对峙法对根瘤菌与假单胞菌的互作关系进行初步研究.结果表明:免培养法从百脉根根瘤内检测到内生菌分属于17门31纲69目103科140属,...     

豆科植物根瘤中接触酶活性和固氮作用

有效的白三叶草和大豆根瘤比无效的根瘤含有较多的接触酶。从有效大豆根瘤中收集的大豆菌株的根瘤菌,比从无效根结构中收集的菌株接触酶的活性较大。在实验室培养基中生长的三叶草根瘤菌的突变株比它们有效亲本的接触酶较少,但是没有发现在实验室生长的大豆根瘤菌培养体中接触酶的含量和有效性之间有什么关系。大豆的有效根瘤较之类似的非固氮根结构的过氧化物酶含量比较丰富,但白三叶草并非如此。大豆根瘤的有效性和酚氧化酶活性之间没有明显的关系。     

苜蓿中华根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定

为了阐明豆科植物共生反应与免疫反应的协调机制,揭示参与植物细胞侵染、定殖及固氮过程中根瘤菌基因的功能,以苜蓿中华根瘤菌Sm2011为材料,构建了约8 000株Tn5-sacB转座子插入的突变体库。利用巢式PCR检测技术,从中鉴定和筛选出nodC、nifH、smc01188和smc04024等4个特定目标基因的插入突变体及其插入位点。通过结瘤试验考察突变体共生及固氮表型,结果显示:植株接种smc01188突变体28d后,与对照植株相比,该基因突变导致根瘤固氮酶活下降,与慢生型大豆根瘤菌该基因突变体的表型类似;smc04024基因突变不影响植株生长,根瘤发育基本正常;接种nifH突变体后,植株呈缺氮表型,生长发育受阻,根瘤为白色;接种nodC突变体后植株不结瘤,说明Tn5-SacB的插入导致nifH、nodC基因功能丧失。利用PCR检测、鉴定和分离目标基因突变体是一种行之有效的方法。     

四棱豆根瘤细胞结构的电镜观察

四棱豆根瘤细跑超薄切片的电镜观察表明:根瘤红色中心组织包含有受根瘤菌(Rhizobium spp.)侵染细胞和非侵染细胞。细菌侵染进入宿主细胞中转变成固氮类菌体。最初可见到有周膜包裹的单个类菌体细胞。在周膜内,类菌体经细胞分裂逐渐形成几个类菌体,这就是发展成熟根瘤共生细胞结构的形态特征。本文还对四棱豆类菌体细胞结构与固氮功能的关系进行了讨论。     

贵州救荒野豌豆高效根瘤菌株的筛选

【目的】筛选获得结瘤固氮能力强、促生效果好的土著高效救荒野豌豆根瘤菌菌株,为贵州喀斯特地区土壤改良应用提供优质菌株资源。【方法】采用刚果红YMA平板分离培养法,对贵州省不同生态功能区的救荒野豌豆根瘤进行分离、纯化,结合菌体形态结构和16S r RNA测序方法进行细菌种类鉴定,将筛选获得根瘤菌株与豆科模式植物百脉根进行盆栽回接试验,结合菌株固氮酶活性的测定,筛选土著高效根瘤菌株。【结果】从贵州省境内不同生态功能区的救荒野豌豆根瘤样品中分离获得53株形态、颜色和大小各异的根瘤细菌菌株,革兰氏染色后,共获得30株革兰氏阴性（G-）纯化菌株,经鉴定8株为根瘤内生细菌,22株为根瘤菌分属根瘤菌属（Rhizobium）和假单胞菌属（Pseudomonas）,其中Rhizobium的分布频率最高,达91%,豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）的分布频率最高,达27%,分别是分离获得的优势属和优势种。将来自不同地域和种类的根瘤菌与百脉根进行盆栽回接试验后,共筛选得到优良固氮促生根瘤菌6株,即XDVR141-4、ZJVR339-3、WEVR362-3、WXVR365-1、WLVR370-5和B...     

黑龙江省土著根瘤菌制剂最佳施用浓度筛选

为了解黑龙江省土著根瘤菌制剂对大豆生长的影响,筛选出最佳使用浓度,以结瘤能力较强的根瘤菌菌株为试材,通过活化、摇床培养设定4个浓度梯度,混拌接种于大豆,在结荚期测定其植株生物量、根瘤鲜重、根瘤干重和根瘤数,并于成熟期对其产量构成因子进行测定分析。结果表明:大豆接种根瘤菌后,叶片颜色深绿、株高升高,单株根瘤数目增加,并在结荚期达到结瘤高峰。根瘤干鲜比随着根瘤菌液浓度的变化呈现抛物线状,菌细胞0.8×108个·mL-1浓度处理的根瘤干鲜比最高,对照根瘤菌液处理的根瘤干鲜比明显高于试验中各菌液处理的根瘤干鲜比。接入根瘤菌处理的大豆生物量均高于菌液对照处理及清水对照处理,菌细胞0.6×108个·mL-1处理的生物量达到最高。低浓度菌液处理的根冠比小于高浓度菌液处理。株高、单株荚数、单株粒数随着根瘤菌液浓度的变化也呈现出抛物线状,菌细胞均以0.6×108个·mL-1根瘤菌液浓度处理最高。根瘤菌液各浓度处理的百粒重变化不大,略高于菌液对照处理而显著高于清水对照处理。因此,黑龙江省土著根瘤菌制剂推荐使用浓度菌细胞0.6×108个·mL-1。     

根瘤菌与灰金合欢及小麦结瘤固氮作用的比较

豆科灰金合欢根瘤的固氮活性，自根瘤幼小时开始上升，成熟时达到峰值，至衰老时又急剧下降．根瘤菌在宿主豆科植物细胞内转变为固氮类菌体时，由宿主受侵染细胞分化衍生出周膜包裹．周膜内最初只有单个类菌体，随后增殖为几个群聚生存．成熟根瘤中含类菌体细胞最多，固氮作用也最大，根瘤衰老阶段固氮活性减低直至丧失．本实验结果表明：使用浓度０．５－１．０μｍｏｌＬ－１２，４－Ｄ和０．２－０．６μｍｏｌＬ－１激动素，并接种根瘤菌ＯＲＳ５７１菌株，可诱发出小麦类似根瘤结构的发育，且可测出微量固氮活性（乙炔还原率），但与豆科根瘤相比低得多．小麦类根瘤的侵染位置发生在根表皮与露出裂隙之间，用电镜照片证明根瘤菌存在于皮层受侵染细胞间隙及其细胞内部靠近核的区域．根瘤菌侵入后能够进行繁殖并可大量堆积     

华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。     

不同施肥条件下接种根瘤菌对鲜食大豆结瘤和产量的影响

为探索不同根瘤菌和减施氮肥对鲜食大豆结瘤和产量的影响,通过盆栽试验,设置不接种根瘤菌常规施肥(CK1)、不接种根瘤菌减氮施肥(CK2)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110常规施肥(U1)、接种慢生型大豆根瘤菌USDA110减施氮肥(U2)、接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436常规施肥(C1)和接种费氏中华根瘤菌CCBAU45436减施氮肥(C2)处理,研究不同施肥水平和根瘤菌接种水平下鲜食大豆的根瘤数、根瘤质量、根瘤固氮酶活性和产量的差异.结果表明,在常规施肥水平下,花荚期C1处理的根瘤数大于CK1处理,差异极显著;根瘤质量、根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C1处理根瘤数大于CK1处理,差异极显著,C1处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量也显著大于CK1,根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.减氮施肥水平下,花荚期U2处理的根瘤数显著大于CK2处理;U2处理的根瘤鲜质量、根瘤干质量显著大于C2处理,与CK2无显著差异;根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.采青期C2处理的根瘤数显著大于U2处理,根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性在各处理间无显著差异.不接种根瘤菌水平下,花荚期和采青期CK1、CK2处理的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量和根瘤的固氮酶活性无显著差异.接种USDA110根瘤菌水平下,花荚期U2处理的根瘤固氮酶活性显著高于U1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在U1处理与U2处理间均无显著差异.接种CCBAU45436根瘤菌水平下,花荚期C2处理的根瘤固氮酶活性显著高于C 1处理,采青期差异不显著;花荚期、采青期的根瘤数、根瘤鲜质量、根瘤干质量在C 1处理与C2处理间均无显著差异.综合说明,接种根瘤菌影响了鲜食大豆的结瘤情况,但对根瘤的固氮酶活性影响不大.减施氮肥影响了花荚期鲜食大豆根瘤的固氮酶活性,但对结瘤影响不大.不同施肥水平和根瘤菌接种水平下各处理间产量均无显著差异,但U2、C2处理的鲜食大豆单株鲜籽粒产量比CK1处理分别提高了4.61％、4.24％,在减施氮肥后接种根瘤菌提高了鲜食大豆的产量.     

氟磺胺草醚及其降解菌对大豆生长及生物固氮的影响

从生长于氟磺胺草醚污染土壤的大豆根瘤中筛选出的Sinorhizobium sp.W16菌株,能高效降解氟磺胺草醚并能缓解氟磺胺草醚的生物负效应。以大豆（苏C1008）为研究对象,采用盆栽试验,探究Sinorhizobium sp.W16对大豆生长、氮累积量、根瘤固氮酶活性及根际土壤氮循环相关微生物功能基因丰度等的影响。结果表明：氟磺胺草醚的施用量（以有效成分计）超过450 g·hm^-2时显著降低了大豆生物量,抑制了大豆根瘤固氮酶活性和土壤脲酶活性,降低了土壤固氮细菌（nifH）、氨氧化古菌（AOA）、氨氧化细菌（AOB）基因丰度,限制了植物-根际系统的生物固氮及有机氮素转化;接种Sinorhizobium sp.W16降解菌显著提高土壤中氟磺胺草醚的降解率至81.97%,且显著提高了大豆根瘤干质量、根瘤固氮酶活性和土壤nifH基因丰度,增强了大豆的固氮作用,同时刺激了脲酶活性,提升土壤AOA和AOB的基因丰度,增加了土壤有效氮素的供应,从而使大豆植株氮含量提高了15.85%~24.93%。研究表明,氟磺胺草醚的施用抑制了大豆-根际系统的生物固氮作用,但接种Sinorhizobium sp.W16降解菌不仅能有效降低土壤中氟磺胺草醚的残留量、缓解氟磺胺草醚对大豆的持续药害,还增强了植物-根际系统中生物固氮能力、土壤有效氮素供应及大豆的氮素累积,对修复氟磺胺草醚污染土壤、增强大豆固氮具有较好的应用价值和市场前景。     

红豆草在旱农地区固氮肥田作用研究(Ⅰ)

本文研究了红豆草(Onobrychis Viciaeffolia Scop)在旱农地区的结瘤固氮作用。研究表明,在该地区红豆草结瘤状况良好,单株根瘤量多达1.9—3.0克,但多属无效根瘤。用乙炔还原法测定根瘤的固氮活性为0.048毫微克乙烯分子/毫克根瘤/分钟。此外,研究了红豆草结瘤固氮的环境因素(包括土壤有效养分、微量元素及水分、光照等)。研究认为,在该地区肥力较低的土壤,需要施用一定氢肥,这对提高红豆草的经济产量是重要的。     

大豆细胞色素P450家族GmCYP78A71固氮功能解析

大豆可与根瘤菌互作进行共生固氮,有效缓解其对土壤氮素的依赖。细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是一种血红素单加氧酶,参与植物信号分子、植物激素和黄酮类等多种次生代谢物的合成,为探究其在大豆结瘤固氮中的生物学功能,分析了该家族GmCYP78A71基因的结构,并对其表达模式及生物学功能进行了深入解析。qRT-PCR和转启动子大豆毛根的根瘤GUS染色表明,GmCYP78A71在根瘤中特异表达,且随着根瘤的发育表达量逐渐增高,在成熟根瘤中达到峰值;与对照相比,超表达复合植株的根瘤个数、鲜重、固氮酶活性等显著提高,而RNAi毛状根的根瘤个数、鲜重、固氮酶活性等显著降低。上述结果表明GmCYP78A71对根瘤的生长发育和固氮发挥重要作用。     

大豆类胡萝卜素裂解双加氧酶GmCCD8固氮功能解析

大豆可与根瘤菌共生进行生物固氮,固氮机制受许多基因诱导调控,类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenases,CCDs)可调控多种植物激素、色素、芳香类化合物的合成与代谢.为探讨其在大豆生物固氮中的功能,从大豆育成品种中黄15中克隆类胡萝卜素裂解双加氧酶GmCCD8基因,分析了该...     

毛萼田菁茎瘤的形成和固氮活性的研究

毛萼田菁(S.rostrata)喜高温、高湿生态环境,在温度20℃以上、相对湿度70—80％的条件下生长迅速,植株可达3.5米以上。 毛萼田菁的茎瘤形成于茎上蛰伏的不定根发生点。当合适的根瘤菌从不定根发生点裂口入侵后,刺激不定根原基周围的皮层细胞分裂形成含菌组织而发育成茎瘤。茎瘤的固氮活性随茎瘤和其中类菌体的发育和衰败而升降。植株的共生固氮周期呈抛物线。茎瘤的固氮活性为根瘤的2.3倍,单株茎瘤的固氮量为根瘤的46倍。植物的光合作用对茎瘤的形成和固氮强度有决定性影响。在正常光照下发育的茎瘤的固氮活性约为包扎遮光下发育的茎瘤固氮活性的1.5倍。     

落叶型大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库的构建

采用ATMT技术建立大丽轮枝菌落叶型菌株XJ2008菌株的T-DNA插入突变体文库,共获得6 043个突变体。从中随机挑选104个突变体,以野生型XJ2008菌株为参照,评价其致病性、菌落生长速率、分生孢子及微菌核的产生能力等。结果表明,有12.5%的突变体丧失产孢能力,4.8%的突变体的生长速率显著减慢,8.7%的突变体的生长速率显著加快,12.5%的突变体丧失产生微菌核的能力,47.1%的突变体的致病性显著低于野生型菌株XJ2008,且突变体2-736、2-740、2-745的病情指数分别约为野生型菌株XJ2008的0.184、0.168和0.197倍。该突变体库突变体遗传稳定性好,性状多样性丰富。     

异源过表达蒺藜苜蓿MtATG7基因促进拟南芥抵抗碳氮饥饿胁迫

【目的】真核生物通过保守的自噬途径降解错误折叠的蛋白质或受损细胞器，实现对营养物质的循环再利用。本文旨在解析苜蓿自噬基因在植物应对营养胁迫中发挥的功能，为指导苜蓿的选育和改良提供参考。【方法】以自噬途径的关键限速基因ATG7(Autophagy-related gene 7)为切入点，分析ATG7氨基酸序列在不同植物中的相似性。利用蒺藜苜蓿Medicago truncatula的MtATG7基因过表达载体转化拟南芥植株，获得异源过表达植株35S::MtATG7和互补拟南芥突变体的atg7/35S::MtATG7植株，并对其抗胁迫表型和自噬活性进行分析。【结果】在碳饥饿条件下，atg7/35S::MtATG7能够挽救atg7突变体叶片早衰的表型；恢复到正常生长条件以后，35S::MtATG7和atg7/35S::MtATG7植株存活率和野生型相比都显著提高。GFP-ATG8e的剪切试验表明，atg7/35S::MtATG7能够恢复atg7突变体的自噬降解活性。在氮饥饿条件下过表达MtATG7同样能够减缓拟南芥叶片的衰老速度。【结论】异源过表达MtATG7能增强拟南芥碳氮饥饿抗性的生物学功...     

豆科植物根瘤形成条件初探

豆科植物的根瘤可以从空气中固定氮气而在贫瘠的土壤中生长。它的形成需要土壤中的根瘤菌或人工培养的根瘤菌与植物共同形成。但根瘤的形成还可由培养根瘤菌的无菌滤液诱导形成,这充分说明根瘤菌生长过程中分泌的某种可溶性物质具有刺激植物形成根瘤的作用,但这种根瘤由于不能形成豆血红蛋白而呈淡绿色或白色,且根瘤中有大量淀粉积累。实验中通过对根瘤的接种、观察、分析,总结了根瘤形成的原因,使我们对根瘤的研究更加深入。     

中国同一纬度不同进化类型大豆固氮特性的研究

本试验研究了中国同一纬度不同进化类型大豆主要生育时期的根瘤固氮酶活性、根瘤酰脲含量和幼茎段酰脲含量。结果表明，根瘤固氮酶活力表现为栽培大豆金元＞半栽培大豆吉５０４５１＞半野生大豆吉５０８５３＞野生大豆生１。根瘤和幼茎段酰脲含量也表现出与根瘤固氮活力类似的趋势。     

百脉根小GTPase ROPs 基因反转座子插入突变体的分离和鉴定

为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析。结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14d后的结瘤数明显减少。